水稻黄单胞菌作为一种植物病原菌,能引起水稻产生白叶枯病,在上世纪八十年代使得水稻大量减产危害严重;随着各种抗性水稻的大面积种植,水稻黄单胞菌的危害明显减少,但是还是零星分布着一些新的生理小种,它们也会对抗性水稻产生危害。目前,黄单胞菌作为一种模式生物,研究水稻黄单胞菌致病变种PX099A可以为其他植物病原菌甚至动物病原菌的研究提供有力的参考,为预防动植物病害的发生提供保障。在植物病原菌中存在许多致病因子,它们通过复杂的调控网络的调控而发挥致病作用。目前研究较多的与致病因子相关的调控通路有双组分信号转导系统、群体感应信号途径和第二信使c-di-GMP信号途径等,在这些途径中都可以发现转录调控因子的身影,转录调控因子用其特定的DNA结合结构域与靶标基因启动子结合,从而参与到这些调控途径中调控下游基因的表达。研究转录调控因子的生物学功能,找寻其分子靶标,完善病原菌致病机理的研究,从而防治水稻病害发生。本课题组前期发现一个转录调控因子可以正调控PX099A的致病性,另外一个转录调控因子负调控PX099A的生长和抗过氧化氢能力,本研究分别将它们命名为Sar(Secretion associated transcription regular)和 Gar(Growth associated transcription regular),并深入研究这两个转录调控因子,找寻其具体的生物学功能。首先验证转录调控因子Sar正调控PX099A的致病性,并对其进行转录组学测定与分析,发现Sar可以调控501个基因的表达,将这些受Sar调控的基因启动子区域全部克隆到细菌单杂载体上,构建启动子亚文库,并用Sar蛋白与这个启动子亚文库进行一对一单杂筛选,共找到76个启动子区域可以与Sar相互作用,预测这些启动子区域的保守性基序,找到三段保守性基序,说明转录调控因子Sar的调控靶标具有一定的保守性。本研究结合转录组学和单杂结果发现,Sar可以通过调控多种分泌系统影响PX099A的致病性。其中Sar正调控Ⅰ型分泌系统(T1SS)基因簇的三个基因raxA、raxB和raxST的表达,并且Sar蛋白可以与raxST启动子结合;Sar负调控Ⅳ型分泌系统(T4SS)三个基因簇基因的表达,并且Sar蛋白可以与其中两个基因簇启动子结合。单杂结果显示Sar蛋白可以与hrpG和hrpX的启动子结合,与Ⅲ型分泌系统(T3SS)基因簇启动子没有相互作用,已有研究报道hrpG和hrpX可以直接调控T3SS,所以说明Sar正调控T3SS是通过调控hrpG和hrpX来进一步调控T3SS基因簇基因,随后又通过细菌双杂实验验证Sar蛋白可以与HrpG蛋白相互作用,绘制了 Sar通过调控hrpG和hrpX调控T3SS基因簇相关基因的模式图。Sar正调控Ⅵ型分泌系统(T6SS)两个基因簇,负调控一个基因簇,并且Sar蛋白均能与这三个基因簇相关基因启动子结合;同时开展不同细菌间共培养实验,验证Sar是否可以通过调控T6SS来影响PX099A对环境的适应性,对PX099A中T6SS的两个特征性分泌蛋白Hcp进行单敲和双敲,将获得的三个敲除突变体以及PX099A、△sar分别与PX099A(pHMI)、Xcc8004以及E.coli XL1-Blue按接种量为10:1进行混合共培养,发现在种内竞争中Hcp1和Hcp2蛋白均无竞争优势,而在种间和属间竞争中,Hcp2蛋白有利于竞争,Hcp1蛋白却不利于竞争,但是在各种竞争环境中△sar与PX099A竞争趋势都一致,猜测可能是两种Hcp蛋白的不同功能平衡了 Sar对PX099A的环境适应性的影响。另外验证了转录调控因子Gar负调控PX099A的生长和抗过氧化氢能力,同样也对Gar进行转录组学分析,发现Gar调控78个基因的表达,其中包括一些膜相关基因;将Gar蛋白与启动子亚文库进行一对一单杂筛选,找到75个启动子与Gar相互作用,其中也包括一些膜相关基因,我们猜测Gar可能通过调控膜相关基因的表达来调控PX099A的生长以及抗过氧化氢能力,但是进一步直接证据还未找到,后续还需要进一步开展电镜观察细菌群体形态以及抗逆性实验,找到影响这一现象的深层次原因。综上所述,我们找到了 Sar影响PX099A致病性的因素,即Sar可以调控多种与致病相关的分泌系统,通过调控分泌系统的功能来达到致病的目的,说明Sar是一个全局性的调控因子,在侵染水稻的致病过程中不可或缺。另外Gar负调控PX099A生长和抗过氧化氢的初步因素,还需要进一步实验探索。