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重组鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)活载体疫苗的研究在近十几年来取得了很大进展,已有多种病原的保护性抗原在FPV中得以成功表达。但迄今为止,国内外重组FPV疫苗仍未在市场上得到大规模的推广应用,其主要原因是受到商品鸡所携带的母源抗体的干扰。因此,克服母源抗体干扰是重组FPV疫苗研究领域亟待解决的一个难题。本研究从筛选更合适的FPV复制非必需区作为外源基因插入位点的角度来探索解决这一问题的方法。我们首先采用定向克隆法筛选并鉴定了FPV的4个新复制非必需区,然后分别以这4个非必需区为外源基因插入位点构建载体以获得表达外源基因的重组病毒,并对重组病毒在SPF鸡和带有不同水平母源抗体的商品鸡上的免疫效力进行了比较,以期得到能够较好地抵抗母源抗体干扰的重组FPV。 1.定向克隆法筛选鸡痘病毒的复制非必需区 根据已发表的美国致病株FPV的基因组全序列设计8对引物,用PCR方法分别扩增4个假定复制非必需区各自的两个侧翼区。利用分子克隆技术将假定复制非必需区的侧翼区、标记基因表达框P11-LacZ先后克隆入载体pBluescript SK(-),所得4个载体(pP12L、pP34L、pP56L、pP78L)与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经数轮蓝斑筛选得到纯化的重组病毒,表明这4个区域(FPV1-2、FPV3-4、FPV5-6、FPV7-8)均为FPV的复制非必需区。重组FPV在CEF上连续传10代,经蓝斑检测和PCR检测,表明所得复制非必需区均具有良好的稳定性。 2.表达新城疫病毒F或HN基因的系列重组鸡痘病毒的构建 对FPV表达载体p11S进行优化,将通过PCR方法获得的多克隆位点(MCS)插入载体p11S中启动子Ps的下游,得到更便于外源基因插入的载体pY11S。将外源基因的启动子Ps分别插入载体pP12L、pP34L、pP56L和pP78L,获得4个FPV表达载体p12LS、p34LS、p56LS和p78LS。用RT-PCR方法获得ZJ1株新城疫病毒(NDV)的F和HN基因。将F基因分别插入pN11S及上述4个表达载体,获得表达NDV F基因的5个重组FPV转移载体pY11SF、p12LSF、p34LSF、p56LSF