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背景类风湿关节炎(RA)是以关节滑膜细胞增生,新生血管形成血管翳,炎性细胞浸润以及软骨和骨结构破坏为病理特征的自身免疫性疾病。其发病机制尚不清楚。滑膜成纤维细胞(SFs)在RA滑膜增生、关节炎症、软骨和骨的侵蚀破坏方面起着关键作用。近来研究发现磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路广泛存在于SFs中,表现为异常活化的状态,从而产生SFs的增殖和凋亡失衡。磷脂酰肌醇-3激酶调节亚单位2(PIK3R2)是PI3K/AKT信号通路的负性调控因子,是微小RNA-126(miR-126)的靶基因。目前越来越多的证据表明,microRNA是一种微调节器,在细胞增殖、分化和凋亡中起关键作用。miR-126,由表皮生长因子样结构域7基因内含子编码(EGFL7),是一种重要的血管生成信号调节因子,可以调节血管功能,维持血管的完整性;同时也发现其参与增殖、侵袭、迁移、耐药。近来microRNA与RA的相关研究成为热点,目前尚无miR-126作用于RASFs相关机制的研究。目的探讨microRNA-126靶向PIK3R2基因通过PI3K/AKT信号通路对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASFs)增殖和凋亡的影响。研究方法1、收取29例RA组行膝关节手术的RA患者和27例对照组行膝关节手术的健康创伤患者的膝关节滑膜组织标本,体外培养滑膜成纤维细胞。采用实时定量聚合酶链反应(RT-q PCR)检测RA组和对照组滑膜组织miR-126和PIK3R2 m RNA的表达;并用Western blot检测RA组和对照组滑膜组织中PIK3R2蛋白的表达。2、应用生物信息Target Scan预测并应用双荧光素酶报告系统确认PIK3R2是miR-126直接作用的靶基因。3、用电穿孔法转染对数生长中期RASFs细胞,分成5组:空白对照组,miR-126模拟组,miR-126模拟对照组,miR-126抑制剂组和miR-126抑制剂对照组。应用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测miR-126对RASFs细胞增殖的影响,应用流式细胞仪检测miR-126对RASFs细胞凋亡的影响,应用Western blot方法检测PIK3R2蛋白及PI3K/AKT信号通路中PI3K、Akt和p-Akt蛋白的变化。结果1、与对照组相比,RA组滑膜组织miR-126表达增加,而PIK3R2 m RNA的表达减低(miR-126:1.93±0.45 vs 0.89±0.22;t=3.596,P=0.023;PIK3R2 m RNA:0.76±0.16 vs 1.43±0.27;t=3.698,P=0.021)。Western blot结果显示,与对照组相比,RA组患者滑膜组织PIK3R2蛋白的表达减少(0.61±0.13 vs 1.27±0.31;t=3.401,P=0.027)。Pearson相关分析表明RA组患者滑膜组织miR-126与PIK3R2 mRNA表达呈负相关(r=-0.742,P<0.001)。2、通过在线microRNA预测网站Target Scan对靶基因进行预测。预测结果表明,PIK3R2是miR-126的靶基因。与共转染control和pMIR/PIK3R2报告基因载体相比较,共转染miR-126 minics和p MIR/PIK3R2报告基因载体后,荧光素酶(Firefly Luciferase)活性明显降低(P<0.05);而共转染inhibitor和pMIR/PIK3R2报告基因载体后,荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。3、CCK结果显示:随着时间的变化,空白对照组、miR-126模拟对照组、miR-126抑制剂对照组3组之间转染RASFs后的细胞增殖率无显著性差异(均P>0.05)。与空白对照组相比,miR-126模拟组和miR-126抑制组在转染后24h细胞增殖率差异无显著性;然而转染48h后,miR-126模拟组细胞增殖率较空白对照组显著增加,而miR-126抑制剂组较空白对照组降低(P均<0.05)。4、流式细胞仪检测结果显示:空白对照组、miR-126模拟对照组、miR-126抑制剂对照组3组之间的RASFs细胞周期比例和细胞凋亡率无显著差异(P均>0.05)。分别与空白对照组相比,miR-126模拟组S期和G2/M期RASFs细胞比例增加,而细胞凋亡率降低;miR-126抑制剂组G0/G1期和G2/M细胞比例增加,而细胞凋亡率增加(P均<0.05)。表明miR-126抑制RASFs细胞凋亡,作用于RASFs细胞周期G0/G1期到S期。5、RT-qPCR结果显示:与空白对照组比较,miR-126模拟组miR-126的表达增加,PIK3R2 mRNA的表达降低;而miR-126抑制剂组miR-126表达降低,PIK3R2 mRNA的表达增加(P均<0.05),提示miR-126靶向PIK3R2并抑制其mRNA的表达。6、Western-Blot结果显示,miR-126模拟对照组、抑制对照组和空白对照组PIK3R2和PI3K/AKT通路相关蛋白(PI3K、Akt和p-Akt)的表达无显著性差异(均P>0.05)。与空白对照组比较,miR-126模拟组PIK3R2蛋白的表达下降(P<0.05),PI3K和p-Akt的表达增高(P均<0.05),Akt的表达稍增高(P>0.05);而miR-126抑制剂组PIK3R2表达增加(P<0.05),PI3K和p-Akt蛋白表达下降(P均<0.05),Akt的表达稍降低(P>0.05)。这些结果提示miR-126能通过抑制PIK3R2蛋白的表达上调PI3K/AKT通路。结论:我们的研究表明,miR-126在RA滑膜组织中过表达。miR-126靶向PIK3R2通过调节PI3K/AKT信号通路促进RASFs的增殖并抑制其凋亡。因此,抑制miR-126可能改善RASFs增殖与凋亡之间的失衡,为治疗RA提供新理论和新武器。