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我们发现耐药的胃癌细胞出现钙周期素结合蛋白(CacyBP)基因显著高表达，但不知其功能。本研究克隆人CacyBP编码基因，构建正、反义核酸真核表达载体(pcDNA3.1／hCacyBP+、pcDNA3.1／hCacyBP-)，分别转染非耐药的胃癌SGC7901细胞和耐阿霉素(ADR)胃癌SGC7901／ADR细胞，研究CacyBP在胃癌多药耐药机制中的作用。 目的 由高表达hCacyBP基因的胃癌SGC7901／ADR细胞中克隆hCacyBP编码基因，构建其正、反义核酸真核表达载体，脂质体介导基因分别转染SGC7901和SGC7901／ADR细胞，研究CacyBP编码基因在胃癌多药耐药机制中的作用。 方法 应用RT-PCR从高表达CacyBP的胃癌耐阿霉素(ADR)细胞克隆CacyBP编码cDNA。Northern杂交检测SGC7901细胞及SGC7901／ADR细胞中hCacyBPmRNA表达水平的差异。将hCacyBP编码cDNA克隆到真核表达载体(pcDNA3.1)构建正、反义核酸真核表达载体(pcDNA3.1／hCacyBP+、pcDNA3.1／hCacyBP-)。以脂质体将上述两种载体分别导人胃癌药敏细胞SGC7901及胃癌SGC7901耐ADR细胞中，通过RT-PCR检测转染细胞中hCacyBPmRNA水平的变化。MTT检测①SGC7901细胞及pcDNA3.1／hCacyBP+、空载体pcDNA3.1分别稳定转染之SGC7901细胞对ADR的药物敏感性；②SGC7901／ADR细胞及pcDNA3.1／hCacyBP-、空载体pcDNA3.1分别稳定转染之SGC7901／ADR细胞对ADR的药物敏感性。流式细胞仪(FCM)检 第四军医大学博土学位论文 一 测①SGC79叮细胞及pcDNA3．1儿CacyBP扒空载体pcDNA3．1分别稳定转染之 SGC7 901 细胞内ADR 蓄积浓度及细胞周期；②SGC7901／ADR 细胞及 pcDNA3．1／hCacyBP一、空载体pcDNA3．l分另稳定转染之SGC7901／ADR细胞内ADR 蓄积浓度及细胞周期。 结果通过RT—PCR方法，成功克隆了人CacyBP全长编码cDNA序列，并构建 其正、反义真核表达载体：Noroer。杂交进一步证实SGC”们从DR细胞中 hCacyBmmA表达水平显著高于SGC7901细胞：转染pcDN＊3．工／hCac3，BP＋的 SGCN 01 细胞中 hCacyBPll－－＊uAIA表达水平显著高于空载体转染及未转染之 SGC7901，与转染空载体pCDNA3．工及未转染之SGC7901 细胞相比，转染 pcDNA3．1／hCacyBP＋之细胞经 MTT检钡其对 ADR药物敏感性较后两者有所降低， 生存率较后两者有所增高。转染PcD叩3．1比CacyBP入空载体PcD狐3．l及未转 染之SGC7901细胞中平均ADR蓄积浓度分别为5．17、5．49、5．64。FCM检测细 胞周期示与未转染之SGC7901相比，转染PcDNA3．1／hCacyBP＋后SGC7901细胞 GI期减少，GZ期及S期增高，转染空载体后SGC7901细胞GI期减少，GZ期及 S期增高：转染pCDNA3．l／hCCCyBP－反义核酸真核表达载体后％C，901／ADR细胞 中hCacyBP。RNA表达水平显著低于空载体转染及未转染之SGC79叮／ADR细胞， 转染pCDM3．l儿C优yBP－之细胞经Mw检测其对ADR的药物敏性较后两者有所增 高，生存率较后两者为低。FCM也证实转染PcDNA3．y／hCac｝，BP－反义核酸真核表 达载体之SGC7卯1乃DR细胞内ADR蓄积浓度较转染空载体pCDNA3．1及未转染之 SGC79们从DR细胞内ADR蓄积浓有所增高；细胞内ADR蓄积浓度分别为6．72。 5．62、5．54cFCM检测细胞周期h与未转染之SGC7叨1爪DR细胞相比转染 pcDNA3．l川CacyBP－后细胞GI期和S期有所增高，GZ期有所降低；转染空载体 后 SGCD01／ADR细胞GI期和GZ期有所降低，S期有所增高。 结论经hCacyBP ％码基因正、反义核酸真核表达载体分别转染胃癌 －5－ 第四军医大学博士学位论文 一 SGC7901及 SGC7901／ADR细胞，现初步证明 hCacyBP＄码基因对胃癌细胞MDR 有一定的影响，因此CacyBP有可能成为胃癌WIR中的重要分子之一，但其具体 作用机制尚需进一步深人研究。