研究背景急性乙型肝炎患者中HBV特异性CD4+及CD8+T细胞通过其表面的T细胞受体(TCR)识别多个病毒抗原表位,产生多克隆的强效免疫应答,控制HBV感染;而在慢性乙型肝炎(CHB)患者的HBV特异性T细胞功能耗竭。核苷(酸)类似物(NUC)抗病毒治疗降低病毒载量及HBV抗原水平,T细胞功能得到短暂性部分恢复。但研究方法局限于组织相容性抗原-肽染色、细胞因子检测等方法。而CHB患者其TCR基因表达变化与抗病毒治疗结局的关系仍未明确。研究目的该研究采用无偏差的5’端cDNA末端快速扩增技术(RACE)扩增TCRβ链(TRB)片段以及高通量测序,深度分析发生乙肝e抗原(HBeAg)血清学转换与否的CHB患者在抗病毒治疗早期其外周血CD4+及CD8+T细胞TRBCDR3的差异;并分析TRB CDR3动态变化与治疗期间HBV DNA以及HBV抗原水平的相关关系。研究方法1.研究对象所有研究对象来源于一项替比夫定治疗临床队列的22例HBeAg阳性CHB患者。收集治疗0、12、24、52、104周血清及外周抗凝血。根据治疗52周及104周的应答情况分为完全应答组(CR,n=10)及非完全应答组(NCR,n=12)。CR组定义为治疗52周及104周HBeAg发生血清学转换及HBV DNA水平<300 copies/mL;NCR组定义为治疗52周及104周HBeAg维持阳性及HBV DNA水平>300 copies/mL;2.分离治疗基线、12周、24周外周血单个核细胞,流式细胞仪分选CD4+及CD8+T细胞,提取总RNA;5’RACE技术及巢式PCR扩增TRB链基因全长;构建测序文库及Illumina Hiseq上机测序;3.测序数据处理及分析采用免疫组库分析软件MiXCR进行V、D、J基因片段比对,识别出有效TRB及CDR3序列。相同CDR3序列称为一种克隆型。根据两两时间点每种克隆型频率变化,分为消失、下降、持续、增生及新增5类克隆型。结果1.CHB患者抗病毒治疗过程中外周血TRB文库多样性分析CR组在治疗过程中其CD4细胞TCR文库多样性比NCR组低,尤其在12周(VDJ组合数量,P=0.035;CDR3氨基酸克隆型数量,P=0.03;Shannon指数值,P=0.041);而CR组CD8细胞TCR文库多样性比NCR组高,尤其在基线(CDR3氨基酸克隆型数量,P=0.041)。纵向分析发现,无论CD4或CD8细胞,CHB患者TRB文库多样性在治疗基线至12周均呈下降趋势,而在CR组患者,尤其在CR组的CD4克隆中(Shannon指数,P=0.022)更为显著。2.抗病毒治疗过程中TRB CDR3克隆动态变化通过分析基线、治疗12周及24周两两时间点克隆型的动态变化,发现在CD4+及CD8+T细胞中,CR组持续克隆型比例显著低于NCR组(P<0.001);CR组新增与增生克隆型比例显著高于NCR组,尤其在基线与治疗12周期间(P=0.021)。CR组新增与增生CD4克隆型的累积频率低于NCR组,在CD8亚群中两组无差异,提示CR组患者的CD4+以及CD8+T细胞存在多克隆增生,但每种克隆型增生个数较NCR组受限。3.HBV血清学指标水平与T细胞克隆动态变化的相关分析治疗12周时CHB患者乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBeAg及HBVDNA水平与CD4、CD8持续克隆型比例呈正相关关系;与新增及增生克隆型比例呈负相关关系(Spearman correlation,P<0.05)。治疗12周较基线时HBeAg水平下降幅度与CD4、CD8持续克隆型比例呈负相关关系;与新增及增生克隆型比例呈正相关关系(P<0.05)。结论在抗病毒治疗早期T细胞针对多表位的强效克隆增生与CHB患者发生HBeAg血清学转换、HBV抗原及病毒载量下降相关。NUC治疗早期T细胞克隆的动态变化对CHB患者T细胞应答重建具有重要作用。将来,NUC联合免疫调节治疗的策略,如过继性回输含有针对多表位嵌合HBV特异性TCR的T细胞,可有望重建T细胞功能,实现对HBV完全的控制。