目的：RNA对基因表达的影响主要包括抑制和活化基因两个方面，这些工作在数十年前就引起了生物学家的重视，近年来在RNA活化基因（RNA激活）方面的资料在不断积累。　　为了研究重复序列在活化基因中的作用，本研究中，使用不同组合的Alu重复序列，例如，两个Alu基因位于同一质粒或不同质粒组合，正义和反义Alu组合等，稳定或瞬时转染HeLa细胞，观察重复序列对EGFP报告基因表达的影响；使用生物信息学分析方法，比较人类 C组染色体着丝粒与其侧翼DNA序列的RNA群结合强度，研究重复序列在RNA激活中的作用，并推理RNA激活的机理。　　方法：　　1、报告质粒和诱导质粒的构建　　2、 PSI-rTetR质粒的构建　　3、细胞转染　　包括瞬时转染和稳定转染,详细方法见正文。　　4、热休克处理　　5、荧光显微镜观察　　将重组质粒转染HeLa细胞后，在荧光显微镜下观察EGFP荧光阳性细胞，并进行照相，计算EGFP表达量。　　6、流式细胞仪检测　　7、序列资料和软件　　从NCBI人类基因组数据库中获得序列资料，用本研究室编写的软件(Gene-Analyser2.0)分析7-nt序列。　　8、计算RNA群结合强度的方法　　RNA群结合强度的算法是基于互补的RNA和DNA越多，RNA和DNA结合的可能性越大的原理来进行计算。具体的计算方法见正文。　　9、 Tet-on系统　　构建Mini-C1-Alu-sense-sense（mini-Alu正正组合）等质粒，转染HeLa细胞用G418稳定筛选,再转染PSI-rTetR质粒，用Puro稳定筛选。得到G418和Puro双抗性的细胞。这些细胞加入Dox和不加Dox进行培养，观察EGFP表达量。　　10、统计学处理　　组间的比较使用均值±SD和t检验。所有的实验重复只少三次，P<0.05认为两组有统计学差异。流式细胞仪分析图是至少3次独立实验的一个代表图。　　结果：　　1、质粒表达载体的构建及鉴定本研究构建了五类表达载体：　　1.1、基于pEGFP-C1质粒构建的表达载体,为报告质粒（Fig.1A，Table1）。　　1.2、基于pcDNA3.1构建的表达载体，为瞬时转染时的诱导质粒（Fig.1B， Table1）。　　1.3、基于PSI构建的表达载体，为稳定转染时的诱导质粒（Fig.1C，Table1）。　　1.4、 mini-C1报告质粒（Fig.1D, Table1）。　　1.5、 PSI-rTetR质粒，用于稳定转染实验（Fig.1E，Table1）。　　2、正义Alu和反义Alu组合后活化EGFP报告基因　　2.1、正反组合的Alu重复序列对EGFP报告基因表达的影响　　Fig.2显示正反组合的Alu序列在稳定转染时活化EGFP报告基因，然而将这些质粒瞬时转染 HeLa细胞时，正反组合的 Alu元件没有活化EGFP基因表达的作用。当两个基因位于不同质粒，不论瞬时还是稳定转染，正反组合的Alu元件均没有明显活化基因作用(Table4-7)。这些结果说明，Alu元件活化基因必需正反组合，必需位于同一质粒，且必需稳定转染。　　2.2、 Alu同源序列对EGFP报告基因表达的影响　　将C1-Alu-sense-AluJB-sense（ Alu正AluJB正组合）， C1-Alu-sense-AluJB-antisense（Alu正AluJB反组合）（Table1）稳定转染HeLa细胞，Fig.3显示两个质粒的EGFP表达量没有明显差异，这两个质粒的EGFP基因表达量显著低于Alu正反组合的质粒，说明组合的正义Alu和反义AluJB元件没有显著活化基因作用。　　3、热休克对EGFP报告基因表达的影响　　将质粒稳定转染HeLa细胞后进行热休克处理，培养不同时间，观察EGFP报告基因的表达。Fig.4显示热休克使Alu正AluJB反组合质粒的EGFP表达量显著上升，在热休克第2-4天达高峰，然后下降，在12天回到热休克前的水平。热休克对Alu正反组合质粒中的EGFP基因表达也有显著促进作用，虽不如Alu正AluJB反质粒表现明显，但是Alu正反组合的热休克反应可以维持更长时间，到热休克第20天，EGFP的表达仍然处于较高水平。　　将其它的对照质粒稳定转染HeLa细胞后也进行热休克处理，热休克4天后测定EGFP的表达量，Fig.5-Fig.6的结果说明其它组合时，热休克均没有使这些质粒中的 EGFP基因的表达显著提高，而且与正反组合无关。　　4、 Tet-on系统实验　　进一步论证了正反组合的Alu序列活化EGFP报告基因的观点(详细实验内容见正文)。　　5、C组染色体着丝粒的RNA群结合强度低　　本研究利用生物信息学分析模拟RNA群与着丝粒序列及其侧翼序列的结合强度。关于RNA群结合强度的具体计算方法见正文。Fig.8和Table8的结果显示着丝粒序列的RNA群的结合强度明显低于侧翼序列。　　结论：　　1、质粒转染实验证明，转录的正反组合的Alu重复序列在稳定转染时能激活EGFP基因表达。热休克使Alu正反，Alu正AluJB反质粒中的EGFP基因的表达显著上升，但是Alu正反质粒较Alu正AluJB反质粒能维持较长时间。　　2、生物信息学分析显示C组染色体着丝粒的RNA群结合强度显著低于其侧翼序列。着丝粒的低RNA群结合强度的结果与提出的RNA激活基因的实验结果一致。