治疗性克隆(therapeuticcloning)是胚胎干细胞技术(embryonicstemcell，EScell)与核移植(nucleartransfer)技术的结合产生的不以生殖为目的新技术，该项技术使许多目前医学上没有有效治疗方案的疾病重新获得治愈的可能。 本研究拟先通过小鼠ES细胞的培养及核移植显微操作技术的练习，建立小鼠核移植后胚胎干细胞(nucleartransferembryonicstemcell，ntEScell)，再进一步探索人的ES细胞的培养及鉴定，来源于IVF低质量废弃胚胎的人ES细胞系建系，为将来治疗性克隆试验的开展建立试验基础。 研究内容包括一下两个部分：第一部分小鼠ntES细胞的建立及鉴定第一节不同品系小鼠ES细胞系的建立与鉴定研究目的1探索建立小鼠ES细胞建系的有效方法。 2对建立的ES细胞系进行鉴定，嵌合体小鼠的获得。 方法1建立小鼠的ES培养体系1.1MEF饲养层的制备取孕12.5～13.5d的KM孕胎鼠，制备MEF，10μg/ml丝裂霉素C作用2-3小时后，重新接种制作饲养层。 1.2小鼠囊胚的获取采用两种方式获取囊胚：(1)dpc3.5-4.5冲洗子宫获取囊胚。(2)dpc2.5天冲洗输卵管收集卵裂球，卵裂球体外培养获取囊胚。 结果1胚胎的收集与培养dpc2.5冲洗输卵管取卵裂球体外培养的方法较dpc3.5冲洗子宫的方法获得的囊胚数量增多，存在统计学差异。 2ICM的分离传代。ICM原代培养4-5天后挑出，重新种植到饲养层上过夜再消化传代的方式，有助于建立不同品系的小鼠ES细胞系。 3小鼠ES系的建立获得了来自BALB/C，C57BL/6，B6D2F1(C57BL/6*DBA/2)，129/SV*DBA/2等4不同品系小鼠的10个株ES细胞。根据其小鼠品系的不同来源分别命名未mES-BALB/C-1，mES-BALB/C-2，mES-C57BL/6-1，mES-C57BL/6-2，mES-C57BL/6-3，mES-B6D2F1-1，mES-B6D2F1-2，mES-B6D2F1-3，mES-B6D2F1-4，mES-129/SV*DBA/2-1。 结论1、dpc2.5冲洗输卵管取卵裂球体外培养的方法较dpc3.5冲洗子宫的方法获得的囊胚数量增多。 2、适合的ICM分离时机与方法的采用有助于提高mES的建系率。原代ICM挑出重新种植饲养层培养过夜再消化传代的方法，有助于ICM的进一步扩增，并且可以去除原代ICM周围的滋养层细胞及部分分化的细胞。 3、本研究获得的10株小鼠ES细胞，具有正常核型，有自我更新的能力，有体内、体外全能分化能力，生殖系嵌合能力检测中。 第二节小鼠ntES细胞系的建立与鉴定研究目的利用piezo装置Hoffman目镜下进行直视下取出小鼠M-Ⅱ期卵母细胞的纺锤体，颗粒细胞供核胞质内注射，获得重构卵，体外激活培养，比较添加TSA激活与传统的Srcl2、CytochalasinB激活法囊胚发育率的不同，利用重构卵囊胚，进行胚胎干细胞培养，对获得的ntES细胞进行相关的鉴定 方法1利用piezo操作系统对B6D2F1小鼠M-Ⅱ卵母细胞进行去核，颗粒细胞作为供核胞质内注射，获得重构卵。 2卵母细胞的去核效果分析随机抽取去核后的卵母细胞2.1H33342染色观察结果，5μg/ml避光染色10分钟，UV镜下观察，细胞核着深蓝色荧光。。 2.2Spindleview软件分析观察去核效果，细胞核部位可以见到强光闪烁。3重构卵的激活 随机将重构卵分为2组，按不同方案激活3.1无TSA激活组：10mmol/LSrCl2，5μg/ml的CytochalasinB的Ca2+freeCZB6小时，转入KSOM培养。 3.2TSA激活组：10mmol/LSrCl2，5μg/ml的CytochalasinB，5nMTSA的Ca2+freeCZB6小时，5nMTSA的Ca2+freeCZB4小时，转入KSOM培养。 激活处理6h，以形成原核为标志。4利用重构卵发育的囊胚，进行ntES细胞的培养、鉴定。 方法同第一节结果1利用piezo操作系统对小鼠M-Ⅱ卵母细胞的去核效果分析。H33342染色，spindleview软件分析观察去核成功率100％。 2添加TSA激活与无TSA激活激活率的比较。激活过程中添加TSA(5nM)能有效的提高重构卵的囊胚发育率，差别具有统计学意义。 3小鼠ntES细胞系的建系获得一株小鼠ntES细胞系，命名为mntES-B6D2F1-1。重构卵ICM的贴壁率，ES细胞建系率明显低于相同品系的正常受精卵(B6D2F1)，差别具有统计学意义 4对所获得的mntES-B6D2F1-1鉴定该细胞系具有典型的ES细胞生长形态特征，核型正常40，XX，正常核型率75％，AKP染色阳性，ES细胞表面抗原检测、分化能力的检测SSEA-1阳性，SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81阴性，具有体外分化成为三个胚层组织的能力。 结论1利用piezo压电操作系统能迅速有效的去除M-Ⅱ期的小鼠纺锤体。 2重构卵的囊胚进行ES细胞的培养，囊胚贴壁率及ES细胞建系率明显低于正常的囊胚。 3重构卵激活培养过程中添加5nM的TSA能明显提高囊胚发育率。 4获得1个ntES细胞系，命名为mntES-B6D2F1-1，核型：40，XX，鉴定符合ES细胞的标准。 第二部分人胚胎干细胞的建系的探索第一节HES-4细胞系的培养与鉴定，同源饲养层培养的研究。研究目的通过Havarduniversity赠送的hES-4细胞株在本实验室的培养传代，对该细胞株进行相关鉴定，掌握人ES细胞培养的方法，探索人ES细胞的同源饲养层培养。 材料与方法1hES-4细胞系：由Havarduniversity赠送。 2hES-4细胞系的鉴定对获得的hES-4细胞进行生长行为及形态特征、核型、碱性磷酸酶活性、ES细胞表面抗原、分化能力的鉴定。 3人胚胎成纤维细胞的培养取孕8-12周的流产胎儿的胚胎组织，分离胚胎成纤维细胞，制作饲养层。 4人儿童包皮成纤维细胞的培养健康男孩的包皮切除术后的包皮组织，分离成纤维细胞制作饲养层。 5STR位点个体识别 结果1hES-4的生长情况。解冻后细胞生长稳定，可以观察到典型的边界清晰的克隆形态，扁平，克隆内细胞呈小圆形，边界清楚，核仁明显，胞核比例大。机械切割及胰酶消化传代均能有效保持该细胞系的体外生长。能进行冷冻复苏。到目前为止，这些细胞系在体外已经分别培养80天，培养代数由赠送初期的24代传到45代。 2hES-4在人胚胎成纤维细胞及人包皮细胞饲养层上的生长情况人胚胎成纤维细胞及人包皮细胞饲养层均能有效支持该细胞系的生长，传代稳定，在本实验室的利用此两种饲养层分别传代已经超过10代，克隆生长典型，保持为分化状态。 3hES-4细胞系的鉴定核型：46，XY/46，XYinv9，15(q22，q26)，嵌合体核型(21∶10)，AKP阳性，SSEA-1阴性，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81阳性，体外悬浮培养能形成拟胚体，拟胚体贴壁生长能分化成为上皮样组织，暂时未进行组织切片检查。 4STR(微卫星序列)个体识别 结论1由Harvarduniversity赠送的hES-4在本试验室能稳定生长传代，解冻复苏。初步鉴定符合hES细胞标准。 2本实验室分离培养的人胚胎成纤维细胞与包皮成纤维细胞作为饲养层能支持hES-4的稳定生长传代，有效维持细胞的不分化状态，保持全能分化的能力。 第二节人胚胎干细胞建系的探索研究目的利用IVF废弃的低质量胚胎外培养，进行人ES细胞建系研究。 方法1收集本院IVF中心适宜进行子宫移植或冷冻的低质量的胚胎。Ⅲ-Ⅳ级胚胎，或者d3卵裂球数目小于4的低质量胚胎。志愿者在知情同意的情况下为医学研究无偿捐献的胚胎。 2采用机械法分离ICM。 结果1胚胎的收集及囊胚的培养本试验共收集d3的废弃胚胎枚44，获得囊胚9枚，囊胚形成率15.9％，ICM为A级的囊胚1枚。志愿者为医学研究进行供卵，获得囊胚4枚，ICM为A级的囊胚2枚。 2原代克隆生长情况IVF废弃胚胎：囊胚9枚，机械法分离共获得ICM7个，原代种植贴壁生长3个，贴壁率为42.2％。 志愿者囊胚：囊胚4枚，机械法分离共获得ICM4个，原代种植贴壁生长3个，贴壁率为75％。 3hES的传代由于本部分研究开始时间较晚，由志愿者供卵获得的囊胚，3个ICM贴壁，均为机械传代4代以后，细胞没有扩增殖，死亡，未能建系。 目前来自IVF废弃胚胎3个ICM正在进行原代或者初次机械分离传代培养，结果尚需要进一步观察。 结论1、IVF废弃胚胎的培养及从低质量囊胚建立ES细胞系有一定困难IVF中心的废弃胚胎，其发育能力较差，囊胚形成率低、质量差，ICM数量少，质量低，通过其它途径获得符合伦理的优质胚胎，是初期成功建立胚胎干细胞系的良好途径。