雷公藤(tripterygium wilfordii Hook. F),又名黄藤根或薜荔木,系卫矛科(cecastraccac)。雷公藤具有很强的生理活性,具有显著的抗炎、抗肿瘤、抗生育及免疫调节作用,临床可用于治疗类风湿性关节炎、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、等50多个病种。雷公藤内酯醇(Triptolide,以下简称TP)是雷公藤属植物分离得到的主要的活性成份之一,其为具有松香烷骨架结构的二萜类三环氧内酯化合物,含有一个独特的三环氧结构和一个α,β不饱和五元内酯环,其分子式为C20H24O6,分子量360。目前,它的全合成已经获得成功。作为一种免疫抑制药物,TP具有很好的抗炎、抗肿瘤及抗生育作用,可应用于许多自身免疫性疾病的治疗,最近又显示其在器官移植抗排斥反应方面具有广阔的应用前景。有关TP在体内的分子靶标研究并不多,目前对TP作用靶标方面的报道仅限于在肿瘤细胞中。有关TP在炎症细胞中的靶标,TP如何通过作用于其靶标而完成其抗炎功能的相关研究尚未见报道。因此,我们在本研究中,运用化学生物学的研究手段,着重探讨了TP在巨噬细胞中的靶蛋白发现及相关机制,研究内容可分为三个主要部分：1.TP分子靶蛋白的鉴定：TP作为半抗原与BSA偶联,免疫小鼠,再取血清效价高的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选得到单克隆融合细胞。进一步采用亲和纯化获得了高纯度的TP单克隆抗体(以下称anti-TP)。利用anti-TP,在巨噬细胞株ana-1的细胞裂解液中共沉淀得到TP的结合蛋白,通过质谱分析和Western-blot检验,得知TP的结合蛋白可能为Tabl。同时我们将TP用荧光基团标记,即用香豆素直接共价偶联TP,其产物(以下称为TP-mmc)在溶液中呈现黄绿色荧光,在ana-1和RAW264.7细胞内,能观察到由TP-mmc发出绿色的荧光。Tab1可以通过抗体荧光染色发出红色的荧光,与TP的绿色荧光相互叠加形成黄色荧光,提示在细胞内TP与Tab1有结合。2.体外鉴定重组蛋白Tab1和TP的结合：为了验证TP与Tab1在体外的结合情况,我们在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了带有his6标签的Tab1蛋白。我们采用同步荧光光谱分析Tab1-his与TP的结合,证实TP在与Tab1结合时能够淬灭Tab1蛋白上的Trp489残基的荧光。我们还利用平衡透析法分析TP与Tab1-his的结合常数,得到最大结合量为3.53μM,最大结合常数为0.116μM-1。此外,我们采用了荧光光谱法分析TP-mmc与Tab-his结合以及通过抗体手段进一步检测Tab1-his与TP的结合情况。为了进一步研究Tab1各功能区在与TP结合中所起的作用,我们对鼠源Tab1基因(编码502个氨基酸)进行了改造,采用保留其N端,分别构建了去除C端的3个编码序列的截短突变体。结果说明Tab1的N端374到416位的氨基酸序列在TP与Tab1结合的过程中起着非常重要的作用,TP可能直接与374-416序列区域发生结合,也可能这段序列对TP与Tab1空间结构的形成起着决定性的作用。3.TP抑制巨噬细胞活化的分子机制通过细胞学实验我们发现TP可以抑制由LPS激活的巨噬细胞的免疫功能,具体表现在：TP可以抑制巨噬细胞的吞噬活性、释放促炎因子TNF-α。那么TP是如何通过靶向Tab1而抑制巨噬细胞活化的呢?我们通过CO-IP的方法证实了TP扮演了拆分Tabl与Tak1结合的角色,同时通过Western-blot验证了Tak1的下游激酶MKK3/6和MKK4的磷酸化水平也受到TP的抑制。我们进一步检测了Tak1/c-jun这条激酶级联放大通路中的关键分子,证实了TP通过与Tab1结合而拆分Tab1与Tak1的作用。小鼠体内验证TP抑制巨噬细胞活化的分子机制为了验证TP在上述巨噬细胞株ana-1上的产生免疫抑制的分子机制,我们建立了相应的由LPS刺激形成巨噬细胞活化的动物模型,在动物水平上验证细胞实验的结论。根据上述实验结果,TP与Tab1结合介导的信号转导过程如下：巨噬细胞经典活化状态下,TP与细胞内的靶蛋白Tab1产生结合,导致Tab1离开Tak1,Tak1磷酸化被阻遏,激酶活性降低,从而抑制了Tak1激酶的底物MKK4和MKK3/6的进一步活化、以及MKK3/6的底物—p38及MKK4的底物—JNK1/2的磷酸化。导致p38和c-jun进核的过程受阻,进而抑制了相关的转录因子活性,导致一些重要的促炎细胞因子如TNF-α, IL-6, IL-12的释放受到抑制,最终形成免疫抑制的结果。综上所述,本实验首先通过小分子抗体pull down的方法及质谱鉴定发现Tab1可能是TP在巨噬细胞内的靶蛋白之一。随后,基于体外基因工程表达技术所获取的Tab1-his蛋白,我们在体外实验体系中进行了TP与Tab1相互作用的分析,获得了TP与Tab1结合的结论。据此,我们运用动物炎症模型和巨噬细胞经典活化模型,分析了TP如何通过与Tab1的相互作用而发挥其免疫抑制功能的相关分子机制。我们的研究发现了TP作用于巨噬细胞的的一个全新的作用靶标,而且可作为对TP的分子结构优化改造的一个新参考。