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背景:非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全球最常见的慢性肝病之一。病因学认为游离脂肪酸水平升高与NAFLD的发生发展有关。一方面过量游离脂肪酸会引起氧化应激反应,从而破坏线粒体功能,受损的线粒体不能产生足够的ATP来维持肝细胞正常功能,导致脂类代谢、血糖调控及蛋白质合成紊乱;另一方面线粒体损伤加剧氧化应激,如此恶性循环下,线粒体膜电位异常,促凋亡因子释放到细胞质中,从而引起线粒体依赖性肝细胞死亡。线粒体功能障碍被认为是高脂引起肝细胞损伤的主要病理机制。因此探索高脂血症损害线粒体功能的分子机制,可以为NAFLD的治疗提供新的方法和思路。受损的线粒体可以通过保护性自噬清除受损部分,以维持其自身结构和功能的稳定,肝内线粒体自噬主要受Bnip3调控。Sirtuin3是一种主要在线粒体中表达的NAD+依赖性脱乙酰酶,在心肌梗塞、糖尿病等多种疾病中对线粒体起到保护作用。当高脂介导肝损伤时,Sirtuin 3是否调控Bnip3介导线粒体自噬、如何通过下游事件最终调控线粒体自噬尚未见报道。目的:本研究旨在阐明Sirtuin 3在NAFLD发生发展中的作用,探究Sirtuin3调控Bnip3介导线粒体自噬的分子机制,寻找线粒体自噬的上游调控信号。方法:分别选取体重无统计学差异的野生型(wild type,WT)小鼠、Sirtuin 3(Sirt3)转基因小鼠进入高脂饮食组和低脂饮食组建立NAFLD及对照的动物模型。同时从上述小鼠肝脏分离原代肝细胞,在体外建立NAFLD的细胞模型。动物水平,利用酶联反应、免疫组化、免疫印迹等实验方法,观察不同组小鼠体重、糖脂类代谢功能的改变、肝脏病理、肝内炎症和纤维化变化程度;细胞水平,利用MTT、TUNEL、酶联反应、线粒体提取、荧光探针、Western Blot、Bnip3干扰RNA敲低、免疫荧光共定位染色等技术,观察不同处理组WT和Sirtuin 3过表达细胞活力、凋亡状态、ROS生成、抗氧化剂变化、线粒体Cyt-c渗出、线粒体膜电位、线粒体自噬及线粒体凋亡通路等变化。观察应用Bnip3 siRNA前后Sirtuin 3过表达细胞线粒体自噬、抗氧化剂、线粒体膜电位、凋亡蛋白表达变化。观察应用ERK-CREB信号通路阻断剂PD98059前后ERK-CREB磷酸化、Bnip3表达、线粒体自噬、ROS生成、ATP生成及炎症因子等变化,从而明确Sirtuin 3对非酒精性脂肪性肝损伤的保护作用,阐明Sirtuin 3通过调控Bnip3介导的线粒体自噬维持线粒体稳态的作用机制。结果:1.体内实验显示高脂饮食诱导WT小鼠体重增加(P<0.05),肝脏重量增加(P<0.05),肝细胞明显增大(P<0.05)、脂肪变性,肝内炎症和胶原沉积。与低脂饮食组相比,高脂饮食WT小鼠空腹血糖、C端肽、糖化血红蛋白和胰高血糖素水平明显升高(P<0.05),甘油三酯、总胆固醇、瘦素、脂联素、丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平明显升高(P<0.05),炎症因子TNF α、IL-6和MCP 1表达上调(P<0.05),胶原蛋白CollagenⅠ、Ⅲ、Ⅳ表达上调(P<0.05),纤维通路相关蛋白TGF β和MMP9两个参数均上调(P<0.05),同时Sirtuin 3在肝内表达下调(P<0.05),但Sirtuin 3转基因小鼠体内能够逆转由高脂饮食引起的肝损伤(P<0.05),减轻炎症反应和纤维化(P<0.05)。2.体外实验显示高脂诱导的WT原代肝细胞与对照组相比活力下降(P<0.05),凋亡增多(P<0.05),Sirtuin 3过表达能够抑制高脂刺激引起的细胞凋亡(P<0.05)。3.功能上,高脂刺激下WT肝细胞线粒体功能异常,ROS表达上调(P<0.05),抗氧化剂GSH、GPx、SOD表达下调(P<0.05),ATP产生受到抑制(P<0.05),线粒体膜电位下降(P<0.05),促凋亡因子细胞色素c释放(P<0.05),促凋亡蛋白表达上调(P<0.05)、抗凋亡蛋白含量下调(P<0.05),但是Sirtuin3过表达细胞维持线粒体功能的稳定,逆转ROS和抗氧化剂的失衡,减少细胞色素c释放(P<0.05),减少线粒体凋亡(P<0.05)。4.机制上,高脂刺激下肝细胞自噬体形成受到抑制(P<0.05),Bnip3表达下调(P<0.05),但Sirtuin 3过表达细胞中Bnip3表达上调(P<0.05)且激活线粒体自噬体形成(P<0.05),Bnip3敲低时尽管Sirtuin 3过表达但是线粒体自噬体形成受到抑制而减少(P<0.05),表明Sirtuin 3通过Bnip3调控线粒体自噬。5.Bnip3敲低时尽管Sirtuin 3过表达但高脂刺激下线粒体功能再次紊乱,抗氧化剂含量下降(P<0.05)、线粒体膜电位降低(P<0.05)、细胞色素c释放(P<0.05),Caspase-9激活(P<0.05),表明Sirtuin 3上调Bnip3表达后,激活线粒体自噬从而维持线粒体功能稳定,减少细胞凋亡。6.分子水平上,高脂饮食WT细胞内ERK-CREB途径去磷酸化(P<0.05),使该途径失活,但Sirtuin 3过表达细胞中逆转ERK-CREB的磷酸化(P<0.05),激活该通路,为了明确该途径是Bnip3介导线粒体自噬的上游介质,在Sirtuin 3过表达细胞阻断ERK-CREB通路,发现Bnip3表达随之下调(P<0.05),线粒体自噬体形成再次受到抑制(P<0.05)。7.在阻断ERK-CREB信号通路途径后,Sirtuin 3过表达对高脂介导的肝损伤的保护作用消失,炎症因子表达增加(P<0.05),TUNEL阳性细胞比例增多(P<0.05),细胞凋亡增多,ROS生成增多(P<0.05),ATP生成受到抑制(P<0.05)。结论:1.体内外功能实验显示Sirtuin 3对由高脂介导的肝损伤具有保护作用,降低炎症和纤维化程度,减少肝细胞损伤和凋亡。2.体外功能试验显示Sirtuin 3维持线粒体结构和功能稳态,抑制线粒体凋亡,拮抗高脂引起的肝损伤。3.机制研究发现ERK-CREB是肝内Bnip3介导的线粒体自噬的上游介质。Sirtuin 3通过磷酸化ERK-CREB途径来激活Bnip3介导的线粒体自噬,清除受损部分,维持线粒体结构和功能稳定,抑制细胞色素c向胞浆渗漏,阻断线粒体依赖性肝细胞死亡,保护其免受高脂刺激造成损伤。4.高脂介导的肝损伤下调Sirtuin 3,随后引起ERK-CREB途径的失活和Bnip3介导的线粒体自噬途径的抑制,最终导致肝细胞线粒体依赖性死亡。