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基于活性导向的化学蛋白质组分析是近年来发展起来的一个新方法,运用于在复杂的生命体系中系统地鉴定某类有特定功能的蛋白质,或与某种小分子有特异结合的蛋白质。该技术在活性小分子靶标蛋白的鉴定,未知蛋白的功能解析和蛋白翻译后修饰位点解析等方面运用广泛。 萜类天然产物是最丰富的一类天然产物,具有结构多样及丰富活性的特点。我们首先选择倍半萜类青蒿素为分子骨架设计探针,由于青蒿素上独特的过氧桥键结构会被亚铁血红素激活生成活性自由基,与相互作用的蛋白残基发生共价交联反应。我们利用活性导向的化学蛋白组学技术,借助于青蒿素骨架探针对其作用靶点蛋白的识别和共价结合修饰的生物活性,在癌细胞蛋白质组中成功“钓”取并鉴定了79个可与青蒿素共价结合的蛋白,揭示了青蒿素对癌细胞产生抑制的可能的分子机制;继续发展的该类探针运用了先结合富集然后解离的策略,解析了青蒿素的靶点蛋白之一恶性疟原虫翻译调节肿瘤蛋白(PfTCTP)与青蒿素的特定结合区域,为解释疟原虫的耐药性机制提供了一些参考。 为了研究萜类化合物的生物合成途径,我们以二萜类贝壳杉烯骨架分子设计探针,研究了在植物甜叶菊中的主要次生代谢产物甜菊糖甙的生物合成途径中的关键糖基转移酶。提取了有催化转糖活性的甜叶菊蛋白裂解液,运用质谱的方法到了甜菊糖苷生物合成途径中未曾报道过活性的糖基转移酶SrUGT73E1,发现了其能够催化甜菊醇C-19位的羧基能够形成糖苷键的新功能,同时发现了新的糖基转移酶SrUGT76G3,丰富了甜菊糖苷的生物合成途径,为构建异源生物合成甜菊糖苷提供了新的选择。 植物激素等活性小分子是一类具有生理活性的微量信号分子,参与了植物的多种生理过程的调控,使植物能适应外界环境。为了研究激素等活性小分子在植物体内的作用机制,我们以倍半萜结构的脱落酸,二萜结构的赤霉酸以及蝶酰谷氨酸结构的叶酸为研究对象,基于ABPP的理念设计并合成了一系列带有光亲和标签的分子探针。利用模式植物拟南芥,通过喂养探针,在体外和体内均标记上了能与探针进行相互作用的蛋白。同时还利用蛋白质谱定性分析了探针结合的蛋白,并且建立了分析模型,对标记的蛋白进行了功能预测倍半萜类小分子。通过预测分析和验证,发现了拟南芥谷氨酰胺合成酶AtGLN14可以特异的与5-甲酰四氢叶酸(5-F-THF)结合,为解释叶酸参与植物的氮循环代谢的机制原因提供了可能的参考依据。 综上所述,本论文运用基于活性导向的分子探针技术,结合化学蛋白质组学,合成生物学,分子生物学以及生物信息学等技术和分析方法,凭借能够共价修饰蛋白的萜类天然产物化学小分子探针,在复杂的细胞或植物组织的蛋白组样本中标记能与小分子相互作用的靶标蛋白,并且对鉴定得到的蛋白进行定性和定量的分析,从中进行生物功能的预测和筛选。