癌症以其高发病率和致死率已经严重威胁了人类的生命与健康。研究表明,Cyclin D1过表达与肿瘤细胞的转移和肿瘤的不良预后相关,Cyclin D1已成为肿瘤治疗的重要靶点。实验室前期研究中,通过噬菌体抗体库筛选,成功制备在体内外具有较好抑瘤效应的抗Cyclin D1单链抗体。然而,单链抗体不能直接跨膜进入细胞并作用于细胞内Cyclin D1靶点。细胞穿膜肽可作为递送载体将治疗剂在不损伤细胞膜的情况下运载穿过细胞膜,有效提高细胞对药物的摄取率,改善治疗效果。而且有研究表明,将细胞穿膜肽与单链抗体偶联,可以增强单链抗体向细胞内的递送,这为单链抗体靶向治疗肿瘤提供了新的途径,具有较好的应用前景。本课题组前期已经成功构建融合穿膜肽的抗Cyclin D1单链抗体ADκ-PTN及ADκ-TAT的原核表达载体,纯化了两种重组单链抗体。研究结果表明融合蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT与抗原Cyclin D1具有较好结合活性,而且融合穿膜肽不影响抗Cyclin D1单链抗体的抗原结合活性。但融合穿膜肽的抗Cyclin D1单链抗体是否能穿过肿瘤细胞的细胞膜与细胞内的Cyclin D1蛋白相互作用,是否能抑制肿瘤细胞的生长和迁移,目前尚不清楚。为此,本论文就融合穿膜肽的单链抗体ADκ-PTN和ADκ-TAT对肿瘤细胞的生长与迁移的抑制效应展开了相关研究。具体工作如下:首先,利用纯化的抗Cyclin D1的单链抗体ADκ及融合穿膜肽的抗Cyclin D1单链抗体ADκ-PTN和ADκ-TAT,处理乳腺癌MCF-7细胞和肝癌Hep G2细胞,通过MTT实验,确定ADκ-PTN和ADκ-TAT能否杀伤MCF-7细胞和Hep G2细胞并确定了最适处理浓度。结果表明,ADκ-PTN和ADκ-TAT均能显著降低MCF-7细胞和Hep G2细胞的存活率,进而抑制肿瘤细胞的生长和增殖。其次,通过荧光素标记ADκ、ADκ-PTN和ADκ-TAT蛋白,处理MCF-7细胞和Hep G2细胞的直接荧光观察实验,以及ADκ、ADκ-PTN和ADκ-TAT蛋白处理MCF-7细胞和Hep G2细胞的间接免疫荧光实验结果,表明融合穿膜肽的抗Cyclin D1单链抗体ADκ-PTN和ADκ-TAT能够穿透细胞膜,进入MCF-7细胞和Hep G2细胞。进一步的免疫共沉淀实验和Western Blot分析结果表明,ADκ-PTN和ADκ-TAT不仅能穿透细胞膜入胞,并能与肿瘤细胞内源表达的Cyclin D1特异性结合。最后,分析了纯化的抗Cyclin D1的单链抗体ADκ及融合穿膜肽的抗Cyclin D1单链抗体ADκ-PTN和ADκ-TAT的抑瘤效应。Annexin V和PI双染结合流式细胞术分析,发现ADκ-PTN和ADκ-TAT显著诱导MCF-7细胞和Hep G2细胞的凋亡。细胞划痕实验结果发现,ADκ-PTN和ADκ-TAT处理组细胞伤口闭合率显著低于ADκ组,表明不论ADκ-PTN还是ADκ-TAT均能抑制MCF-7细胞和Hep G2细胞的迁移。Transwell实验分析发现,无论是MCF-7细胞还是Hep G2细胞,ADκ-PTN和ADκ-TAT组穿过小室的细胞数均明显少于ADκ组及PBS阴性对照组,而ADκ组与PBS阴性对照组穿过小室的细胞数无显著差异,即ADκ-PTN和ADκ-TAT降低了MCF-7细胞和Hep G2细胞的体外侵袭和浸润能力。综上,融合穿膜肽的抗Cyclin D1单链抗体能穿过肿瘤细胞的细胞膜,与细胞内的Cyclin D1蛋白相互作用,并有效抑制肿瘤细胞的生长和迁移。本研究不仅为靶向Cyclin D1的抗体肿瘤治疗奠定了理论基础,也为靶向细胞内抗原的肿瘤治疗提供了实验依据。