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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是一种猪上呼吸道的常在菌,能够从健康猪的鼻、气管和扁桃体中分离得到,在正常情况下不呈现临床症状,但在特定条件下可侵入机体,从而引起猪多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等疾病。近几年,随着我国养猪业规模化和集约化的发展,该病以继发的方式存在于各规模化猪场,并呈逐年上升趋势,增加了断奶到保育阶段仔猪的发病率及死亡率,给养猪业带来了巨大的经济损失,已成为严重影响养猪业的重要细菌性疾病之一。 近年来,对HPS的致病机理与毒力因子的研究更加受到国内外学者的重视,但这些毒力因子是否与HPS的毒力密切相关,还需要进一步研究。明确HPS的致病机理及毒力因子对HPS的预防与治疗具有重要意义。 为了深入了解HPS的血清型流行情况及该病与其他病原体的混合感染情况,从我国部分地区送检的186份新鲜样品中共分离鉴定得到57株HPS分离株,分离率为30.6％,其中血清4型和5型是该菌流行的优势血清型,HPS与PRRSV混合感染所占比例最高。研究还发现该病春、秋、冬季的发病率要高于夏季,且多发于4~7周龄的保育猪。对16SrRNA的PCR产物进行测序及序列比对结果发现许多菌株在243-244位为CT,在256-258位为AAG,在417-421位为ACATA,这为HPS疫苗菌株血清型的筛选及该病的防治提供了重要的参考依据。 为了进一步明确PRRSV与HPS的相互作用,选取32头4周龄健康仔猪进行攻毒试验,结果发现共感染组和HPS组仔猪体温明显高于PRRSV组和对照组(P<0.05),而且共感染组在攻HPS后的1~3d体温明显高于HPS组(P<0.05)。HPS组比共感染组有更严重的纤维素性心包炎、腹膜炎症状。荧光定量PCR检测各个脏器细菌含量,发现心脏和肺脏含菌量明显高于其它组织,且心脏含菌量最高;共感染组含菌量明显高于HPS组,阴性对照组无变化。试验结果说明, PRRSV能加快感染HPS猪只的死亡速度,对HPS有一定程度的协同增殖作用。 选取不同血清型的HPS分离株对仔猪和BALB/c小鼠进行攻毒试验,比较该菌对两种动物的致病性。结果表明,相同血清型的HPS分离株对仔猪和BALB/c小鼠的毒力一致,这为研究HPS分离株的毒力奠定了基础。 采用抑制消减杂交的方法,使LC株(血清1型)与ZQ株(血清4型)中共有的基因片段得到有效的差减,而仅存在与LC株中的特异性表达基因得到特异性扩增。利用克隆技术,成功构建HPS差减文库,再通过斑点杂交技术,得到差异片段,送测序后,经同源序列分析获得的差异片段,主要以编码限制性修饰系统、外膜蛋白、代谢相关蛋白、调节与转运相关蛋白、DNA合成相关蛋白、噬菌体相关蛋白为主,还有许多未知功能蛋白。通过PCR结合小鼠攻毒试验,分析差异基因与HPS分离株的毒力的关系,进一步确定了4个基因(hsdR,hsdS, gpT和ompP2)是HPS的毒力基因。试验还发现HPS同一血清型的不同分离株的毒力存在相当大差异,而且菌株的分离部位与毒力也存在一定的关系。本研究为进一步探究HPS强毒力菌株和弱毒力菌株之间的差异以及毒力基因的功能研究奠定了重要基础。 选择HPS的毒力基因ompP2和gpT,克隆至真核表达载体,成功构建重组质粒pCI-neo-ompP2和pCI-neo-gpT,转染Marc-145细胞,观察24h、36h和48h细胞形态的变化,两种质粒转染后,均能引起细胞死亡,通过Western-blot方法鉴定不同时间段蛋白的表达量,发现随着时间的增加蛋白的表达量也逐渐增加,这初步确定ompP2基因和gpT基因与HPS毒力有关,为下一步构建HPS缺失株提供了参考依据。 利用同源重组技术成功构建HPS LC株的缺失株LCΔompP2株,并对野生型菌株和缺失株的生长特性和毒力进行了研究,结果证实ompP2基因的敲除对菌株的生长造成了一定的影响,而且ompP2缺失株对仔猪的毒力明显减弱,说明ompP2的确是HPS的毒力基因。本研究通过构建HPS缺失株LCΔompP2,为深入探讨ompP2基因的功能,特别是野生型菌株与缺失株LCΔompP2在粘附方面的功能提供了条件,并为进一步研制HPS新型疫苗奠定了基础。