关节软骨可能因为疾病、创伤或者逐渐年老等原因受损。由于软骨组织的自我修复能力有限,组织工程的发展为软骨的临床治疗提供了新的解决思路。为了提高细胞在支架中的分布与生长,本论文拟结合微胶囊与水凝胶的特点,以“人工细胞”为基元、低熔点琼脂糖(low melting point agarose,LMPA)水凝胶为填充介质构建软骨组织。实验考察了人工细胞-水凝胶复合体的制备以及在体外(静态、摇床和三维微重力)构建软骨组织的可行性。希望通过本论文的研究,证明该构建方法可行且有效,从而为体外组织工程的构建提供一个新的思路。首先,体外培养C5.18细胞,其生长曲线表明它是一种增殖迅速的细胞,传代培养24 h后即进入对数生长期,群体倍增时间为57.8 h,在48-144 h内是最佳取样时间。对体外培养的C5.18细胞进行组织学染色,HE(hematoxylin-eosin)染色结果可见软骨细胞的典型形态;阿利新蓝和番红染色结果表明,C5.18具有合成糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)的能力;Masson染色结果说明,C5.18具有分泌胶原蛋白能力。制备不同细胞包埋密度的微胶囊,其细胞分布均匀、球形度好和表面光洁,粒径分布为150-280μm,平均粒径220μm。经AO/EB染色后细胞多呈现绿色荧光,说明细胞存活率较高,微囊化操作并未影响细胞活性。经人工细胞与LMPA复合后得到复合体,形状规则,具有一定的机械强度。经AO/EB染色,发现细胞存活率较高,可进一步用于体外软骨组织构建。其次,将制备得到的微胶囊和复合体分别在静态、摇床和三维微重力条件下培养,并将培养基进行有和无b FGF处理,进行定量(细胞增殖、GAG含量以及Col-II含量)和定性(AO/EB、HE、阿利新蓝、番红-O和免疫组化染色)检测分析。静态条件下:微胶囊和复合体中细胞活力与相应的GAG和Col-II分泌量在第七天时达到最高。且第五天时细胞定性结果呈阳性,之后的染色结果逐渐呈阴性,伴随着细胞量下降。加入b FGF后细胞增殖显著加快,第十天时细胞活性最高,且相应染色结果均为阳性。摇床条件下:微胶囊和复合体中细胞活力在第十天时达到最高且相应染色结果呈阳性。加入b FGF后细胞增殖加快,最高点出现在第十五天,且此时细胞染色结果表明,细胞分泌的GAG和Col-II达到最大,同时可观察到细胞聚集体形成。虽然摇床条件和b FGF的加入促使了细胞聚集体的形成,但传质效果依然影响软骨构建。因此,仍未达到理想的体外软骨组织构建目标。微重力条件下:微胶囊和复合体中细胞的活性和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)量在第十五天时达到最高。在加入b FGF后细胞表现出明显的优势,细胞增殖和分泌ECM速度加快,并在第二十天达到最大值,相应分泌物染色结果在前二十天均呈阳性,与此同时形成100μm左右的聚集体。综上所述,体外培养的C5.18细胞增殖速度快,并具合成GAG和胶原蛋白能力。通过高压静电法可获得尺寸合适、细胞分布均匀和活性高的人工细胞。经人工细胞与LMPA复合后得到的复合体具一定机械强度且细胞活性高。在静态和摇床培养条件下无法得到尺寸大和细胞活性强的细胞聚集体。但在三维微重力培养条件,并加入b FGF后,可以得到直径为100μm左右、活性强和ECM分泌量高的细胞聚集体,这为软骨组织的体外构建提供可能。