目的:恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是黑色素瘤细胞来源的一种恶性肿瘤，发病率为全部恶性肿瘤的4％-5％，占皮肤恶性肿瘤的5-10％。随着人类活动对大气环境中的臭氧层破坏加剧，近年来MM的发病率逐渐增加，年增长率大概为3-5％，较其他大部分的恶性肿瘤的发病率增长幅度都要高。黑色素瘤的恶性度较高，早期即容易发生向其他组织器官的转移，目前尚无特效疗法，对放射治疗和化学治疗均敏感度较差。MM患者的总体5年生存率不到10％，晚期黑色素瘤5年生存率大约在5％左右，为预后较差的恶性肿瘤之一。因此，研究恶性黑色素瘤的发生机制，探索有效控制黑色素瘤侵袭和转移的途径，对于寻找黑色素瘤新的治疗靶点、减少其转移和复发、进一步改善预后和患者的生存质量等都具有重要的理论和实际意义。　　星形胶质细胞升高基因-1（astrocyte elevated gene-1，AEG-1），也被称做异黏蛋白或者转移黏附蛋白(metadherin，MTDH)，是2002年由Su等人在HIV-1感染或肿瘤坏死因子-α诱导的人胚胎星形胶质细胞中发现，逐渐受到广泛深入研究的新基因。AEG-1基因定位于人染色体8q22区域，此染色体位点与入神经胶质瘤等多种恶性肿瘤的发生有密切相关。AEG-1基因在正常组织细胞中表达水平较低，甚至无表达，但在恶性肿瘤细胞中常检测到过度表达。近年来多项研究证实，AEG-1基因在多种恶性肿瘤（如胃癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌等）组织中高表达，并参与肿瘤的发生和发展过程，包括增殖、侵袭、血管生成、转移、上皮间质转化(EMT)和化疗耐药等。另已有研究表明AEG-1基因在恶性黑素瘤组织中呈现高表达趋势，并与黑色素瘤的进展有关。然而，AEG-1基因在恶性黑色素瘤发生过程中的作用并不十分清楚，有待进一步研究。　　RNA干扰(RNA interference，RNAi)，是由双链RNA(double strandedRNA，dsRNA)诱导的，在细胞内对其特异性同源的信使RNA(mRNA)产生降解作用，进而引起基因表达沉默的过程，目前广泛应用于恶性肿瘤的治疗研究中。研究表明化学合成的siRNA(small interfering RNA)具有高效的抑制作用，但受转染效率的影响较大，并且容易在细胞内被降解，作用持续时间较短;而采用构建的短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)的质粒表达载体，转染至细胞内之后，在细胞内Dicer酶的作用下，生成对应的siRNA再发挥RNA干扰作用，能够有效地延长目的基因的抑制作用时间，对基因表达的沉默作用更为持久有效。故本研究通过构建AEG-1的shRNA干扰质粒，稳定转染至体外培养的黑色素瘤细胞内，通过一系列细胞功能学等的实验，来观察抑制AEG-1基因的表达后，黑色素瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学行为的变化情况，并探讨可能与之相关的一些机制，为寻找MM基因疗法的新靶点提供实验依据。　　研究方法:本研究首先以人黑色素瘤细胞系A375、A875、MV3为实验材料，应用Western blot方法检测出AEG-1表达水平较高的两株细胞用于后续实验;将体外构建的pGCsi-H1-AEG-1的干扰质粒和pGCsi-H1-control的对照质粒，分别转染至黑色素瘤细胞内，之后经过G418的抗性筛选，获得相应shRNA的稳定转染细胞系，用Real-time PCR法检测稳转细胞中AEG-1的mRNA表达情况，用Western blot法检测稳定转染细胞中AEG-1的蛋白表达水平，分别从转录和翻译水平来验证AEG-1基因沉默成功。之后CCK-8实验检测黑色素瘤细胞的增殖情况;流式细胞术检测黑色素瘤细胞的细胞周期;Western blot检测黑色素瘤细胞中Cyclin D1、CyclinE、CyclinB的表达水平;Hoechst染色及流式细胞术检测黑色素瘤细胞的凋亡情况;Western blot检测黑色素瘤细胞内凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax的表达情况;Transwell实验（加基质胶和不加基质胶）分别检测黑色素瘤细胞的侵袭和迁移能力;Real-time PCR和Western blot检测黑色素瘤细胞中MMP-2和MMP-9的表达水平;明胶酶谱实验检测黑色素瘤细胞中MMP-2和MMP-9的活性。构建裸鼠黑色素瘤移植模型，绘制肿瘤生长曲线、HE染色检测各组瘤组织的形态及免疫组化检测各组瘤组织中AEG-1的表达以观察AEG-1基因沉默对黑色素瘤的抑制效应。　　结果:1.Western blot结果显示，3个黑色素瘤细胞株A375、A875、MV3均表达AEG-1，其中以A375、MV3中AEG-1蛋白的表达水平较高，以A375、MV3细胞系用作亲代肿瘤细胞(parental cell)，用于后续实验。2.成功建立RNAi表达载体稳定转染A375、MV3细胞系。Real-time PCR及Western blot检测结果显示pGCsi-H1-AEG-1转染组中AEG-1基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显低于parental组及PGCsi-H1-control转染组，而parental组与pGCsi-H1-control转染组相比并无明显区别。提示RNAi表达载体介导的AEG-1沉默能够在转录和翻译水平有效的抑制AEG-1的表达。3.CCK-8实验结果显示，pGCsi-H1-AEG-1转染组与parental组及pGCsi-H1-ontrol转染组相比，细胞的增殖能力明显减弱。流式细胞术结果显示与对照组相比，pGCsi-H1-AEG-1转染组细胞中，处于G0/G1和G2/M两期的细胞比例增多显著，而S期的细胞比例则降低明显。Western blot结果显示pGCsi-H1-AEG-1转染组细胞周期蛋白CyclineD1、E、B的表达显著减少。以上结果表明沉默AEG-1基因可以将细胞生长阻滞于G0/G1期，延缓细胞周期，从而抑制细胞增殖。4.Hoechst染色的典型结果显示pGCsi-H1-AEG-1转染细胞较对照组细胞荧光强度高，具有明显的凋亡小体。流式细胞术AnnexinⅤ-FITC/PI染色检测结果显示pGCsi-H1-AEG-1转染组细胞凋亡比例明显高于parental组与pGCsi-H1-control转染组。Western blot结果表明pGCsi-H1-AEG-1转染组细胞Bcl-2蛋白表达明显减少，Bax、cleaved-caspase-3蛋白的表达明显增多。以上结果表明AEG-1基因的沉默促进了黑色素瘤细胞的体外凋亡。5.Transwell检测结果显示与对照组相比，pGCsi-H1-AEG-1转染组侵袭及迁移的细胞数目均明显下降。Real-timePCR及Western blot结果表明pGCsi-H1-AEG-1转染组细胞中MMP-2和MMP-9在mRNA和蛋白水平的表达均明显低于对照组。明胶酶谱实验结果显示pGCsi-H1-AEG-1转染组细胞中MMP-2和MMP-9的活性明显低于对照组。上述结果表明RNAi表达载体介导的AEG-1沉默可能通过下调MMP-2和MMP-9的表达进一步抑制了黑色素瘤细胞的体外侵袭和迁移。6.各组裸鼠的黑色素瘤细胞的皮下种植瘤100％获得成功，从各组肿瘤生长曲线可见，pGCsi-H1-AEG-1转染组与parental组和pGCsi-H1-control转染组相比，瘤体生长缓慢，瘤体体积、重量均明显下降，说明沉默AEG-1基因的表达后，裸鼠的肿瘤形成能力明显降低，肿瘤生长明显受到抑制。　　结论:1.携带了AEG-1干扰片段的质粒稳定转染人黑色素瘤细胞A375、MV3后在翻译和转录的水平均有效地沉默了AEG-1基因，为后续实验打下基础。2.RNAi介导的AEG-1基因沉默在体外实验可以显著抑制人黑色素瘤细胞A375、MV3的增殖、侵袭及迁移能力，延缓细胞周期，促进细胞的凋亡。3.RNAi介导的AEG-1基因沉默在体内环境下能够使裸鼠活体肿瘤的生长受到显著抑制，与体外试验结果一致。4.AEG-1有可能成为预防、治疗黑色素瘤侵袭和转移的潜在靶点，RNA干扰技术能够成功地沉默AEG-1基因的表达，能为恶性黑色素瘤的基因靶向治疗提供一个新思路，有潜在的临床应用前景。