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二化螟Chilo suppressalis (Walker)是水稻的重要害虫之一,对我国水稻的稳产、高产造成严重的影响,尤其在我国南方稻区经常连年爆发,为害严重,造成巨大的经济损失。长期以来,防治二化螟主要以化学防治为主,有机磷类、氨基甲酸酯类等类杀虫剂在二化螟防治中都得到广泛的使用,但是持续、大量、尤其是不合理的使用杀虫剂,也给二化螟造成很大的抗性选择压力,致使我国不同地区的二化螟对常用的杀虫剂都产生了不同水平的抗性。害虫抗药性涉及到表皮穿透能力下降、解毒代谢能力增强和靶标分子敏感性下降。酯酶基因点突变、基因扩增和表达量上升是导致昆虫体内解毒代谢能力增强的重要机制。此外,酯酶是一个庞大的超基因家族,在昆虫体内不仅参与外源化合物的解毒,还具有营养代谢、信息传导调控,以及保幼激素的代谢调控等重要功能。本文利用转录组数据,对二化螟体内的酯酶基因进行了克隆验证,并利用诱导试验筛选杀虫剂代谢相关酯酶基因,克隆其全长,为进一步分析不同酯酶在不同杀虫剂代谢中的作用提供理论依据。现将研究结果总结如下：1.酯酶基因筛选验证及杀虫剂可诱导基因的分析为了弄清二化螟体内参与杀虫剂解毒代谢的酯酶基因,本章利用二化螟转录组数据,首先对各种酯酶基因进行了筛选和扩增验证,结果获得了68条不同的羧酸酯酶基因序列。此后通过诱导试验,利用半定量RT-PCR对比分析不同酯酶在三唑磷和氯虫苯甲酰胺诱导前后的表达量变化,通过电泳条带的亮度寻找与解毒代谢相关的基因。结果发现,经氯虫苯甲酰胺诱导后,供试二化螟体内68条酯酶基因中有4条,Cs.EXE2、Cs.EXE4、Cs.EXE5、Cs.EXE6表达量明显升高,三唑磷诱导后也有4条基因的表达量明显上升,分别是Cs.EXE1、Cs.EXE3、Cs.EXE4、Cs.EXE5,其中有2条与氯虫苯甲酰胺诱导的基因相同。分析认为这些基因可能分别参与了这2中杀虫剂的解毒代谢,属于杀虫剂代谢相关的酯酶基因。2.二化螟酯酶基因的全长克隆及同源性分析本研究采用RACE技术将半定量筛选到的与二化螟解毒代谢相关的六个酯酶基因进行全长克隆,分别命名为Cs.EXEl、Cs.EXE2、Cs.EXE3、Cs.EXE4、Cs.EXE5、 Cs.EXE6,并利用序列分析软件对全长序列进行分析。结果表明,六个基因的cDNA全长在1700bp-2500bp之间,开放阅读框(ORF)在1400bp-1700bp之间,编码约479-560个氨基酸,除Cs.EXE2外,Cs.EXEl, Cs.EXE3, Cs.EXE4, Cs.EXE5和Cs.EXE6的催化三联体结构Ser-Glu-His,活性中心均具有为GXSXG结构,均具有酯酶基因的保守序列。经过同源性比对和系统进化树分析,目的基因与家蚕、蜜蜂、赤拟谷盗等昆虫酯酶基因存在极高的相似性,大都在84-99%之间。上述结果进一步证实所克隆的6个基因是二化螟的酯酶基因。3.解毒代谢相关的酯酶基因的表达分析由于二化螟酯酶基因较多,序列结构相似性较高,为了避免利用转录组数据中筛选片段进行半定量RT-PCR分析可能出现的错误,本研究利用全长酯酶基因和定量PCR技术,对半定量RT-PCR筛选到的6个基因,重新进行诱导验证。检测氯虫苯甲酰胺和三唑磷诱导前后目的基因的表达量情况,结果表明,通过定量PCR检测到的目的基因的表达量与半定量RT-PCR筛选到的基因的表达趋势相同,这6个酯酶基因的表达量在诱导后都出现了明显的上调,氯虫苯甲酰胺诱导后4个相关酯酶基因的表达量上升了2.5-3.5倍,三唑磷诱导后,其相关酯酶基因的表达量是对照表达量的1.5-7.5倍之间。这些研究结果进一步证实,这6个酯酶基因是二化螟体内可诱导的酯酶基因,与氯虫苯甲酰胺和三唑磷等杀虫剂的解毒代谢有关。