系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus, SLE)是一种累及多器官、多系统,严重危害人类健康的自身免疫性疾病。其主要发病机制为B细胞过度活化产生大量自身抗体,与自身抗原形成免疫复合物,沉积于多器官,造成其炎症反应和组织损伤。SLE的发病与多种因素有关,如遗传、性激素、吸烟、感染、药物等环境因素,其确切的发病机制不清。近年来的研究表明,表观遗传机制异常在SLE的发生、发展中起着重要作用。MicroRNAs (miRNAs)为表观遗传调控重要机制之一。miRNAs是非编码RNA分子中最大的一个亚型,长度约19-25个核苷酸。miRNA可通过与靶mRNA的3’端非翻译区、编码区或5’端非翻译区结合形成RNA诱导的沉默复合体,抑制翻译或引发mRNA降解,从而调控蛋白编码基因的转录后翻译(RISC)[1-3]。最近研究表明,miRNA通过转录后基因沉默调控至少60%的人类蛋白编码基因[4]。miRNA在调节和促进免疫系统发育中起重要作用[5],可以作为多种疾病诊断的生物学标志物或治疗靶点[6]。目前已有很多关于研究miRNA的报道,如miR-155[7]、miR-326[8]、miR-23b[9]、miR-126[10]、 miR-142-3p/5p[11]、miR-146a[5]、miR-182[12]、miR-150[13]和miR-124[14]等通过影响T、B细胞的功能,进而导致自身免疫性疾病的发生。在人类多种自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病和类风湿关节炎,已经发现多种miRNA的异常表达。然而,miRNA在SLE的发病机制中的具体作用还需要进一步研究。目前miR-1246只在人类和猿类基因组中被发现,在人类其编码基因位于染色体2q31.1上,近期有研究报道miR-1246异常表达与P53调控有关,从而参与唐氏综合征及肿瘤的发病机理[10,15,16]。也有研究报道称血清学检测miR-1246可作为食管鳞状细胞癌诊断及预后的生物学指标[17]。然而关于miR-1246在自身免疫疾病中的发病机制尚未有任何研究报道。本课题前期通过miRNA芯片技术研究比较11例SLE患者与11健康对照者B细胞miRNA表达谱的差异,发现与健康对照组相比,miR-1246在SLE患者B细胞中表达降低。将样本量扩大后进行real-time PCR验证了miR-1246在SLE患者B细胞中表达下调。同时我们也证实了miR-1246低表达与Akt异常活化抑制P53表达有关。而且我们证实了EBF1是miR-1246靶基因。用miR-1246抑制剂处理健康对照组B细胞后,发现EBF1表达明显上调,B细胞过度活化,产生抗体增多。相反,过度表达miR-1246导致SLE患者B细胞中EBF1的表达水平下调,B细胞活性降低,抗体产生减少。同时我们还发现miR-1246通过调控EBF1的表达,使BCR信号通路AKT磷酸化水平发生改变,从而调控P53的表达水平,使miR-1246的表达进一步发生变化。通过这些研究揭示了miR-1246低表达可能是导致SLE B细胞过度活化的重要分子机制,为寻找治疗SLE有效的新生物学靶点提供了理论依据。第一章SLE患者B细胞MIR-1246表达与Akt信号调控第一节SLE患者B细胞miR-1246、Akt、P53表达水平目的：研究SLE患者B细胞MIR-1246表达是否异常?及其分子机制为何?方法：1.密度梯度离心分离30例活动性SLE患者、20例非活动性SLE患者及20例正常人外周血单个核细胞,磁珠分离B细胞；2.提取总RNA和总蛋白；3.实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测miR-1246及P53mRNA表达水平；4.蛋白质印迹(Western blot)检测Akt总蛋白及磷酸化水平、P53蛋白表达水平。结果：与正常对照组相比,SLE患者B细胞miR-1246明显下调(p<0.001), P53mRNA及蛋白水平均明显下调,Akt磷酸化水平明显增高,差异均有显著统计学意义(P<0.05或P<0.01)。但Akt总蛋白水平无明显差异(P>0.05)。Akt磷酸化水平与P53蛋白表达水平成负相关(P<0.001)。P53mRNA及蛋白表达水平与miR-1246表达水平成正相关(P<0.05或P<0.001)。结论：SLE患者B细胞中MIR--1246低表达可能与Akt活化后抑制P53的表达,进而抑制miR-1246的表达有关。第二节激活或抑制Akt信号通路对B细胞MIR-1246表达的影响目的：观察激活或抑制Akt对MIR-1246及P53的表达影响方法：1.密度梯度离心分离三例正常人及三例活动性SLE患者外周血单个核细胞,磁珠分离B细胞；2.培养：将Akt激活剂(Akt activator)或阴性对照(Negative control)加入正常人B细胞中培养；将Akt抑制剂(Akt inhibitor)或阴性对照(Negative control)加入SLE患者B细胞中培养；3.提取总RNA和总蛋白；4.实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测miRNA及P53mRNA表达水平；5.蛋白质印迹(Western blot)检测Akt总蛋白及磷酸化水平、P53蛋白表达水平。结果：1.加入Akt激活剂的正常人B细胞,Akt总蛋白水平无明显差异(P>0.05),Akt蛋白磷酸化水平升高,P53mRNA及蛋白水平降低,miR-1246表达下调,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。2.加入Akt抑制剂的SLE患者B细胞,Akt总蛋白水平无明显差异(P>0.05),Akt磷酸化水平降低,P53mRNA及蛋白水平升高,miR-1246表达升高,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。结论：Akt激活能抑制B细胞P53表达从而抑制B细胞miR-1246的表达。抑制Akt磷酸化能上调B细胞P53表达从而上调miR-1246的表达。第二章SLE患者B细胞miR-1246靶基因表达水平第一节miR-1246靶基因的预测与验证目的：验证Ebfl为miR-1246的靶基因。方法：1,运用Mirbase/Targetscans/PicTar等靶基因预测软件查找miR-1246可能的靶基因,从中筛选出可能与SLE发病过程密切相关的基因作为候选靶基因,我们选择Ebfl为miR-1246的潜在靶基因。2.构建萤火虫荧光素酶表达载体：将包含Ebfl的3’-UTR区克隆至pMIR-REPORTER Luciferase vector (Ambion)载体编码荧光素酶基因序列下游,构建Ebfl野生型(EbflWT-luciferase)荧光素酶报告基因质粒,同时采用点突变的方法使Ebfl-3’-UTR中miR-1246的结合位点发生碱基突变,构建突变型(EbflMut-luciferase)荧光素酶报告基因质粒。3.转染：EbflWT-luciferase和EbflMut-luciferase与miR-1246模拟物(miR-1246mimic)和阴性对照(Negative control)用电穿孔法瞬时共转染至Jurkat细胞。4.转染48小时后收集细胞,运用双荧光素酶报告基因检测系统,以海肾荧光素酶作为内参照,检测萤火虫荧光素酶的活性。结果：1.通过生物信息学预测软件发现多个miR-1246的潜在靶基因,Ebfl基因为其中之一；2.在Jurkat细胞中共转染miR-1246模拟物,可以抑制Ebfl野生型(Ebf1WT-luciferase)荧光素酶活性(p<0.05),而当Ebfl-3’-UTR突变修饰后(EbflMut-luciferase), miR-1246不能抑制其活性(P>0.05)。结论：Ebfl为miR-1246的靶基因,miR-1246通过作用于3’端UTR区抑制靶基因Ebfl表达。第二节SLE患者B细胞miR-1246靶基因Ebfl表达水平目的：观察miR-1246靶基因Ebfl在SLE患者B细胞的表达水平方法：1.密度梯度离心分离正常人20例、活动性SLE患者30例的外周血单个核细胞,磁珠分离B细胞；2.试剂盒提取总蛋白；3.蛋白质印迹(Western blot)检测Ebfl蛋白表达水平。结果：与健康对照组相比,SLE患者B细胞Ebfl蛋白表达水平升高(P<0.01),且与miR-1246表达水平呈显著负相关(R=-0.82,P<0.001)。结论：miR-1246靶基因Ebfl在SLE患者B细胞表达增高,且与miR-1246表达水平呈显著负相关。第三章miR-1246表达异常与自身免疫反应目的：研究抑制或过表达miR-1246表达对Ebf1、Akt信号通路及自身免疫反应的影响方法：1.密度梯度离心分离三例正常人、三例活动性SLE患者的外周血单个核细胞,磁珠分离B细胞及CD4+T细胞；2.转染：miR-1246抑制物(miR-1246inhibitor)或阴性对照(Negative control)用电穿孔法瞬时转染至正常人B细胞。miR-1246mimic或阴性对照(Negative control)用电穿孔法瞬时转染至SLE患者B细胞；3.TB孵育ELISA方法检测自身B细胞IgG抗体产生水平；4.流式细胞仪检测B细胞CD40,CD80,CD86蛋白表达；5.试剂盒提取总RNA和总蛋白；6.实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测miRNA、P53mRNA,CD40mRNA,CD80mRNA,CD86mRNA的表达水平；7.蛋白质印迹(Western blot)检测Akt总蛋白及磷酸化水平,Ebfl及P53蛋白表达水平。结果：1.转染miR-1246抑制物的B细胞表现为miR-1246水平降低；Ebfl蛋白水平增高；自身B细胞的IgG抗体产生水平增加；CD40mRNA,CD80mRNA,CD86mRNA及蛋白均表达升高;Akt蛋白磷酸化水平升高；P53mRNA及蛋白水平降低；差异均有显著统计学意义(P<0.05或P<0.01)。但Akt总蛋白水平无明显差异(P>0.05).2.转染miR-1246mimic的B细胞表现为miR-1246水平增高；Ebfl蛋白水平降低；自身B细胞的IgG抗体产生水平降低；CD40mRNA,CD80mRNA,CD86mRNA及蛋白均表达降低; Akt蛋白磷酸化水平降低；P53mRNA及蛋白水平升高；差异均有显著统计学意义(P<0.05或P<0.01)。但Akt总蛋白水平无明显差异(P>0.05).结论：抑制miR-1246表达可升高正常人B细胞Ebfl蛋白表达水平,促进Akt信号通路激活,使B细胞具有自身免疫反应性。过表达miR-1246表达可降低SLE患者B细胞Ebfl蛋白表达水平,抑制Akt信号通路,从而抑制自身免疫反应。