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甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)因其叶片可提取高甜度(甜度约为蔗糖的250～450倍)、低热量(热量仅为蔗糖的1/300)的甜菊糖苷而备受关注。除了作为甜味剂使用,越来越多的研究表明甜菊糖苷还具有预防和治疗肥胖症、糖尿病、高血压、高血糖以及消炎、抗氧化、抗菌、抗癌和增强免疫力等药用价值。甜菊叶片所含甜菊糖苷有多达30种组分,各种组分因为连接在苷元甜菊醇上的糖基种类和数量不同,其甜度、味质、生物活性等性能過异。其中甜菊苷(Stevioside,ST)和莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)为两大主要组分,占总糖苷含量的60～80%。ST苷的甜度为蔗糖的250～300倍,略带苦味,具有药用价值;RA苷的甜度为蔗糖的350～450倍,具有更接近蔗糖的甜味。因此为了满足不同需要,提高单一糖苷组分含量是甜菊育种的目标之一。本论文主要包括两部分研究内容:一、通过对甜菊杂交后代的筛选获得一个ST苷含量较高而RA苷含量近缺失的优异单株,并以ST苷向RA苷转化过程中的关键基因SrUGT76G1为着眼点,从基因和蛋白质水平探寻了该单株RA含量极低的原因;二、分别采用RT-PCR半定量和荧光定量PCR的方法分析了甜菊糖苷合成途径15个相关基因的转录水平和关键基因SrUGT76G1的表达特性,并通过SrUGT76G1基因启动子的克隆和序列分析研究了该基因的表达调控模式。主要研究内容和结果如下:1、通过高效液相色谱法对甜菊品种’中山3号’、’中山4号’(简写为Z03、Z04)及两者自然杂交得到的37个F1代单株进行了ST苷和RA苷含量(干叶质量比)测定,结果表明ST苷含量变化范围为1.18%～9.83%;RA苷含量变化范围为5.15%～15.36%;ST苷和RA苷的总含量变化范围为10.26%～19.67%;RA苷与两苷总含量比值的变化范围为34%～90.42%,均近似服从正态分布。在所测样品中,杂交后代单株011的糖苷含量测定结果与亲本及其他单株差异较大,其ST苷和RA苷的总含量为干叶质量的16.29%,ST苷含量为15.9%,而RA苷含量仅0.4%,这在同期测定的其他甜菊品种及杂交后代等约500个样品中也是罕见的。随后将单株011定名为’中山5号’,简写为Z05。2、根据前人对甜菊糖苷生物合成途径的研究,已经明确尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶SrUGT76G1催化甜菊醇C-13位C-3’的糖基化,将ST苷转化为RA苷,因此本研究从RA苷含量较高的Z04和低RA苷含量的Z05中分别克隆SrUGT76G1基因,通过序列比对分析,探寻Z05叶片ST苷含量较高而RA苷含量近缺失的原因。结果发现单株Z05的SrUGT76G1基因DNA序列中存在一个杂合的无义突变c.389 T>G(p.L121 X),同时在该基因的另一个拷贝中存在一些导致蛋白质结构改变的碱基替换。为了进一步验证这些碱基突变对酶功能的影响,本试验以Z04和Z05叶片中的葡萄糖基转移酶粗提液进行体外酶反应,以ST苷标准品为反应底物,尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)为糖基供体,以RA苷的产出量为标准,比较Z04和Z05的SrUGT76G1酶活性。液相色谱测定结果显示来自Z04叶片的酶液反应后有RA苷色谱峰出现,而Z05叶片提取的酶液反应后没有可见的RA苷色谱峰,由此认为发生在Z05 SrUGT76G1基因中的序列突变确实导致了酶功能的下降。3、为了了解甜菊糖苷合成相关基因的表达特性,试验同时对甜菊糖苷生物合成途径中15个相关基因进行了RT-PCR半定量分析,研究了不同温度(15℃、25℃、35℃)、水分胁迫、光周期(8L/16D、10L/14D、14L/10D、16L/8D,L=Light、D=Dark)、和不同生长阶段对相关基因转录水平的影响,并对各处理下甜菊叶片中的甜菊糖苷含量进行了HPLC法测定。15个甜菊糖苷合成相关基因的半定量分析结果表明在25℃处理下各个基因的转录水平较高;其中基因SrDXS、SrDXR、SrMCT、SrCMK、SrMDS、SrHDS、SrHDR、SrIDI、SrGGDPS、SrCPPS1、SrUGT85C2和SrUGT76G1在15℃和35℃处理下转录受一定程度的抑制;干旱处理抑制了糖苷合成相关的大部分基因的转录;不同生长阶段对基因的转录水平影响较大,在快速生长期15个基因的转录水平均相对较低;基因SrDXS、SrDXR、SrMDS、SrHDR、SrGGDPS、SrKS1-1和SrUGT74G1在现蕾期转录水平最高;开花期时SrCMK、SrIDI、SrKO1和SrUGT85C2基因的转录水平比现蕾期有所增加,在15个基因中只有SrMCT、SrHDS、SrCPPS1和SrUGT76G1的转录水平在现蕾期和开花期没有显著差异。糖苷含量测定结果表明随着植株的生长发育叶片中糖苷含量逐渐增加,至现蕾期达到高峰,开花后则下降。4、SrUGT76G1基因相对表达量的荧光定量PCR分析结果表明16小时的长日照处理下SrUGT76G1的相对表达量是短日照处理下的7.42倍;处于快速生长期、现蕾期和开花期的叶片SrUGT76G1相对表达量分别为对照的0.41倍、0.72倍和82.74倍,可见SrUGT76G1表达量受光照周期和植株个体发育的影响较大。在一天中以4:00所取叶片为对照,8:00叶片中SrUGT76G1平均相对表达量为对照的1.64倍;12:00时SrUGT76G1相对表达量上升为对照的1699.75倍;16:00、20:00和24:00时叶片SrUGT76G1的相对表达量分别为对照的69.25倍、24.94倍和24.60倍。5、为了进一步了解SrUGT76G1基因的表达调控模式,本试验采用hiTAIL-PCR的方法克隆到SrUGT76G1翻译起始位点上游2283 bp的启动子序列。利用PlantCARE、PLACE等在线工具分析该段序列,发现有475个顺式调控元件,除了TATA-box、CAAT-box、MYB结合位点等保守元件,还有光等环境因子响应元件、植物激素响应元件和组织特异性表达元件等。通过克隆SrUGT76G1转录起始位点上游1989bp带酶切位点的序列,将其替换植物表达载体pCAMBIA1301-220中的CaMV35S启动子,连接下游的GUS报告基因,构建重组植物表达载体pCAMBIA1301-220-UGT76G1P,以 pCAMBIA1301-220 载体作对照,通过农杆菌介导的基因瞬时表达初步证明了该段序列序列具有启动子活性,能驱动GUS基因在拟南芥和甜菊叶片中表达。