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目的:STAT3现已被公认为癌基因,它在多种肿瘤细胞中均有显著持续的过量表达,在结直肠癌细胞中亦是如此。新兴的RNA干扰技术(RNA interference,RNAi),它的高效准确及高度特异性使其逐渐替代其它传统的基因治疗手段成为基因治疗的有力工具。本研究旨在应用经小干扰RNA (short interfere RNA,siRNA)表达盒介导的RNAi对结直肠癌细胞中的STAT3基因进行干涉作用以研究STAT3-siRNA对STAT3基因表达阳性的结直肠癌细胞凋亡的影响。方法:1细胞培养选取人源SW480结直肠癌细胞系及人成纤维细胞,分别进行传代培养用于实验。2 RT-PCR方法分析STAT3基因表达水平引物设计软件设计RT-PCR所需STAT3及β-actin基因引物。Trizol试剂提取两种细胞总RNA ,逆转录生成互补DNA(complementary DNA, cDNA)。以cDNA为模板,扩增人STAT3及β-actin基因片段,凝胶电泳检测两种细胞内STAT3及β-actin基因的表达情况。回收纯化含有STAT3基因的凝胶条带,自动测序仪测序分析所得STAT3基因的序列。3合成siRNA表达盒按一定原则设计并合成针对STAT3基因的siRNA表达盒(STAT3-SECs)所需的下游引物后PCR(Polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)合成siRNA表达盒。凝胶电泳鉴定PCR产物片段大小,回收纯化后,自动测序仪测序分析所得产物的序列是否与实验设计相同。4转染细胞参照转染试剂的操作说明,将靶向于STAT3基因的siRNA表达盒转染至人结直肠癌SW480细胞与人成纤维细胞中,同时设立人成纤维对照组、SW480对照组、SW480空转染试剂组、SW480错配链-SECs组。5观察细胞形态变化转染后48小时于倒置光显微镜下观察细胞表象变化;再取转染后48小时的细胞进行Hoechst33342/PI双染后置于荧光显微镜下观察其形态学变化。6 RT-PCR(RT-polymerase chain reaction,逆转录PCR)分析STAT3 mRNA的表达变化Trizol试剂分别提取转染后48小时各组细胞的总RNA(ribonucleic acid,核糖核酸),逆转录生成cDNA。以cDNA为模板,扩增人STAT3及β-actin基因片段,凝胶图像分析软件读取分析二维图像,对比STAT3基因与β-actin基因表达的变化情况。7流式细胞仪检测转染后细胞凋亡峰及周期变化50ml培养瓶接种靶细胞,转染48小时后制成细胞悬液,经处理后上流式细胞仪分析。结果:1癌基因STAT3表达水平的检测人成纤维细胞与人结直肠癌SW480细胞都可以检测到在350bp处β-actin基因与400bp处STAT3基因的表达;但相对于人成纤维细胞,人结直肠癌SW480细胞在400bp处STAT3基因的条带更深。凝胶图像分析软件,以β-actin作为内参照物,读取分析二维图像显示的数据经统计学处理得出:人结直肠癌SW480细胞中的STAT3表达量为人成纤维细胞的3.10±1.16倍,存在显著性差异(P<0.01)。提示癌基因STAT3在人结直肠癌细胞SW480中高表达,在正常人成纤维细胞中表达较低。2测序结果STAT3基因测序结果经比对证实RT-PCR得到的大小约为400bp左右的产物为STAT3基因序列;siRNA表达盒测序结果经比对证实siRNA所含结构与实验设计的序列相符。3细胞形态学观察3.1倒置显微镜下人成纤维STAT3-SECs组相比于人成纤维对照组的细胞未有明显变化:呈梭形,细胞生长排列致密、漩涡状;SW480错配链-SECs组、SW480空转染试剂组与SW480对照组细胞数目均增多、贴壁状况良好、细胞多呈梭形或多角形、大小适中铺满整个视野,核仁清晰、可见核分裂相;而SW480 STAT3-SECs组细胞数目减少、贴壁状况不好,形态不规则、排列紊乱且有较多漂浮细胞,细胞出现不同程度的皱缩及空泡、核质比率倒置、核分裂相减少,细胞密度下降,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞内可见多个折光性较强的圆形小泡样结构和细胞出芽样改变,细胞间失去正常接触抑制,细胞碎片增加、背景颗粒增多。随着STAT3-SECs浓度的不断加大,相应的细胞变化程度也随之加大。3.2荧光显微镜下经Hoechest33342/PI双荧光染色后,人成纤维STAT3-SECs组、SW480错配链-SECs组、SW480空转染试剂组与SW480对照组均未见明显的凋亡现象:大量的正常活细胞被染成蓝色,胞膜完整,细胞核结构正常;少量的死亡细胞被染成红色,细胞核结构正常;而SW480 STAT3-SECs组可见凋亡细胞被染成蓝色,染色质高度浓缩、边缘化,凝集成明亮的团块,即凋亡小体,部分细胞形态不规则,细胞变小,并有核碎裂现象;一些细胞被染成红色,但可见明显的染色质凝集,即凋亡后继发死亡的细胞。随着STAT3-SECs浓度的不断加大,细胞凋亡的比例也相应加大。4转染后RT-PCR结果人成纤维细胞的STAT3-SECs与对照组在350bp处与400bp处平行的均一条带提示:两组的β-actin基因与STAT3基因的表达量并无明显变化;SW480对照组、SW480空转染试剂组、SW480错配链-SECs组在350bp处及400bp处平行的均一条带提示:三组间的β-actin基因与STAT3基因的表达量并无明显变化;SW480 STAT3-SECs组在400bp处模糊的特异性条带提示STAT3基因的表达量减少,而350bp处有一清晰的特异性条带则提示β-actin基因表达量无明显变化。采用Bio-Rad公司PDQuest 7.0凝胶图像分析软件,以β-actin作为内参照,读取分析二维图像显示的数据经统计学处理得出:SW480 STAT3-SECs组中STAT3的表达量较SW480对照组减少了62.16±12.50%,存在显著性差异(P<0.01)。而人成纤维STAT3-SECs组较人成纤维对照组,SW480空转染试剂组和SW480错配链-SECs组较SW480对照组的STAT3表达量差异均无显著性意义(P>0.05)。5流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测结果SW480 STAT3-SECs组细胞于转染后48小时较SW480对照组、SW480空转染试剂组、SW480错配链-SECs组出现了明显的细胞凋亡,在正常二倍体细胞的G0-G1期前出现的亚二倍体峰即为凋亡峰AP;凋亡细胞百分比由0.2%增加至26.0%;S期细胞比率分别由32.3 %下降至9.2%。结论:1癌基因STAT3在结直肠癌细胞SW480中高表达,而在人正常成纤维细胞中的表达较低。2针对癌基因STAT3设计的siRNA能够发挥对高表达癌基因STAT3的结直肠癌细胞SW480的干扰作用,表现为:大量癌细胞凋亡,S期细胞减少,癌基因STAT3的表达下调。3 STAT3-siRNA只对高表达癌基因STAT3的结直肠癌细胞有着RNA干扰作用,而对低表达癌基因STAT3的正常人成纤维细胞无干扰作用。