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天然免疫系统是机体防御病原微生物入侵的第一道防线。当微生物侵入机体时,天然免疫细胞能够迅速识别并激活相应的免疫反应,促进免疫系统杀灭并清除入侵的病原微生物。这一识别过程主要通过位于细胞膜或者细胞内的模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)来实现的,它可以识别某些病原微生物共有的高度保守的分子结构,如蛋白质、核酸、脂蛋白、脂多糖等等,称为病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)。目前已知的PRRs主要包括TLRs(Toll-like receptors)家族、NLRs(NOD-like Receptors)家族、CLRs(C-type lectin receptors)家族、RLRs(RIG-I-like receptors)家族和一些胞浆DNA感受器(DNA sensors),其中DNA感受器是识别胞浆DNA的一类重要PRRs,在抗病毒免疫反应中具有重要作用。正常情况下DNA只存在于真核细胞的细胞核和线粒体中。在病毒感染或细胞损伤时出现在胞浆中的游离DNA是一种重要PAMP。这些DNA被胞内DNA感受器识别并激活干扰素反应,在机体的抗病毒免疫中发挥重要作用。cGAS是2013年被鉴定到的一个胞内DNA感受器,被认为是识别胞浆DNA的最主要受体,在胞浆DNA诱导的干扰素通路中具有重要作用,同时cGAS介导的信号通路过度激活与多种自身免疫疾病密切相关。目前对于cGAS信号通路的调控知之甚少,寻找该信号通路新的关键调控因子,有助于我们深入认识机体抗病毒天然免疫反应的调控机理,也将为治疗自身免疫性疾病提供新的靶点及策略。本课题通过质谱鉴定到cGAS的相互作用蛋白质G3BP1(GTPase-activating protein-(SH3domain)-binding protein 1)。G3BP1具有核酸结合能力。已知G3BP1能够启动组装一个由多种蛋白和mRNA组成的复合体-应激颗粒(Stress Granules,SGs),从而在细胞抗病毒免疫特别是抗RNA病毒免疫中具有重要作用。然而,G3BP1是否参与胞浆DNA诱导的免疫反应尚未见报道。为了研究G3BP1在胞浆DNA诱导干扰素通路中的作用,我们首先利用CRISPR/Cas9技术构建了G3bp1基因敲除细胞系。在多种不同来源的胞浆DNA刺激下,敲除G3bp1都能明显抑制胞浆DNA诱导的信号通路激活和I型干扰素产生,表明G3BP1在DNA诱导的I型干扰素通路中具有重要的正向调控作用。cGAS作为一种核苷转移酶,在识别并结合胞浆DNA后会发生构象改变,并迅速催化ATP和GTP形成小分子第二信使cGAMP(Cyclic GMP-AMP),进而激活接头蛋白质STING及下游信号通路,引起转录因子IRF3(Interferon-regulatory factor 3)活化,启动I型干扰素表达。利用cGAMP刺激细胞,我们发现G3BP1缺失并不影响cGAMP诱导的信号通路激活,提示G3BP1对DNA诱导I型干扰素通路的调控作用可能是通过调节cGAS功能实现的。cGAMP作为cGAS的产物,其合成量直接指示了cGAS酶活性。我们用LC-MS/MRM(Liquid chromatography-mass spectrometry with multiple-reaction monitoring)技术直接检测胞浆DNA诱导cGAMP的量,结果发现G3BP1缺失显著影响cGAMP合成,证明G3BP1对cGAS的调控作用是通过影响cGAS功能实现的。已知G3BP1具有解旋酶活性,能够部分解离双链DNA和双链RNA,所以我们推测G3BP1可能参与cGAS识别DNA的过程。我们构建了DNA-binding实验体系,发现G3BP1缺失明显降低了cGAS对DNA的结合能力。由此证明G3BP1是通过影响cGAS的DNA结合能力调控DNA诱导的I型干扰素产生。DNA病毒感染细胞时,会将自身DNA注入细胞进行复制和蛋白质表达。这些DNA也会被胞浆DNA感受器识别,激活干扰素通路,引发抗病毒效应。为了研究G3BP1在抗DNA病毒免疫反应中的作用,我们利用DNA病毒HSV1(Herpes simplex virus 1)感染细胞并检测I型干扰素产生以及病毒复制情况,发现G3BP1缺失明显抑制DNA病毒诱导的I型干扰素产生,与此同时,对HSV1 mRNA和病毒滴度的检测显示HSV1复制能力在G3BP1缺失细胞中明显增强,说明G3BP1在抗DNA病毒的免疫反应中具有重要作用。综上,在本项研究中我们鉴定到一个胞浆DNA识别信号通路新的功能调控分子G3BP1,并阐释了G3BP1通过调控cGAS的DNA结合能力影响其功能的分子机制,揭示了G3BP1在抗DNA病毒感染中的重要作用。已知G3BP1通过SGs在抗病毒特别是RNA病毒的免疫反应中具有重要作用。我们的研究发现G3BP1通过调节cGAS的功能影响I型干扰素产生,在DNA病毒诱导的免疫反应中也发挥关键作用。这一结果为深入认识cGAS的功能调控机制和G3BP1在抗病毒免疫中的功能提供了新的实验依据。我们的实验结果提示G3BP1有可能作为抗病毒免疫和自身免疫性疾病治疗的新靶点。