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表面展示技术可以将脂肪酶以融合蛋白的形式通过锚定蛋白展示在微生物细胞表明，并保持其相对独立的空间构象。利用该技术作为脂肪酶固定化的一种方法，制备绿色全细胞生物催化剂，可以解决游离酶易失活、难以回收利用等缺点。米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae lipase，ROL）在油脂加工和食品工业等方面拥有广阔应用前景，但天然酶表达量少、酶活较低限制了其工业化应用；已有研究证实在生物柴油制备工艺中，褶皱假丝酵母脂肪酶与米根霉脂肪酶存在协同催化作用，可大幅提高生物柴油转化率。基于此，本研究采用基因工程手段将米根霉脂肪酶和褶皱假丝酵母脂肪酶LIP1（Candida rugosa lipase1，CRL1）共展示在毕赤酵母细胞表面，作为全细胞催化剂用于催化乌桕籽油生物柴油制备，以为生物柴油制备工艺开辟新途径。主要研究工作及结果摘要如下： （1）首次克隆含前序列的米根霉脂肪酶基因（proROL）构建基于 pPIC9K的展示载体 KpRS，将米根霉脂肪酶展示在毕赤酵母 GS115细胞表面；通过抗性平板和三丁酸甘油酯酶活检测平板筛选，获得一株水解橄榄油酶活高达121.99U/g干细胞的重组菌株。经免疫反应处理后，通过正置荧光显微镜检测到明亮的绿色荧光，经流式分析展示率高达97.48％。该单展示ROL的重组菌株制备的全细胞催化剂酶学性质为：最适碳链长度为C8，最适温度为45℃，最适pH为7.6；与游离酶存在微小差别。 （2）克隆经优化的褶皱假丝酵母脂肪酶lip1基因（CRL1），构建基于pPICZα的毕赤酵母展示系统；经抗性平板和三丁酸甘油酯酶活检测平板筛选，获得一株水解橄榄油酶活高达359.62 U/g干细胞的重组菌株。经免疫反应处理后，通过正置荧光显微镜检测到明亮的红色荧光，流式分析其展示率高达96.50％。经酶学性质分析，展示CRL1最适碳链长度为C8，与游离酶存在差别；最适温度和pH为40℃、7.8~8.0，与游离酶保持一致。 （3）将表达载体KpRS和ZCS分别电转化GS115/ZCS和GS115/KpRS单展重组菌株，经双重抗性平板和三丁酸甘油酯酶活检测平板筛选，分别获得一株GS115/CpRS重组菌株（水解橄榄油酶活高达405.00 U/g干细胞）和另一株GS115/pRCS重组菌株（酶活高达470.59 U/g干细胞）。较单展示ROL重组子和单展示 CRL1重组子分别提高了约3.9倍和1.3倍。将共展重组子 GS115/CpRS和GS115/pRCS分别经过免疫反应处理后，在正置荧光显微镜下均可以观察到明显的绿色和红色荧光；流式分析结果显示，共展示重组子GS115/CpRS中ROL和CRL1展示率分别为97.75％和98.91％，重组子GS115/pRCS则分别为98.81％和97.14％；表明共展示成功。对共展示ROL和CRL1全细胞催化剂的酶学性质分析表明，最适碳链长度为C8，最适温度为40℃，最适pH为8.0。 （4）将展示重组子作为全细胞催化剂催化乌桕籽油制备生物柴油，对其反应条件进行了初步优化。共展示系统构建的ROL和CRL1复合酶催化体系的脂肪酶甲酯得率为单展示ROL的1.4倍，说明ROL和CRL1之间存在协同效应。