低氧是我们生活中一种常见现象，许多生理病理过程都伴随着低氧，如新生儿低氧、高原反应、心肌梗塞、创伤、缺血、中风等。对大多数脊椎动物来说，充足的供氧是生存的先决条件，而脑由于其耗氧量高，是低氧后最先受损的器官之一。缺血/低氧预适应(Ischemic/hypoxic preconditioning，I/HPC)现象最早由美国学者Murry等于1986年在心脏上发现。脑I/HPC则最早由Kitagawa等人于1990年报道，即事先对沙鼠给予亚致死性、短暂的脑部缺血刺激后可使神经元对后续重度缺血产生耐受。关于I/HPC存在两种不同的概念：一种是组织器官受到缺血低氧刺激后几分钟到数小时内诱导的早期耐受，称之为“经典或早期I/HPC”；另一种是缺血或低氧刺激后，数天发生的晚期耐受，即晚期I/HPC或第二保护窗口(second window ofprotection)。这两种I/HPC的产生机制和存在时间不同。早期I/HPC一般在诱发后的2小时内消失，其发生与细胞内的信号转导通路的变化有关，如蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性的改变；而晚期I/HPC在刺激24-72小时后产生，其机制与基因表达的改变和新蛋白的合成有关。由脑FHPC引起的组织保护机制为临床防治缺血/低氧性脑损伤提供了新策略。对脑I/HPC机制的探讨，尤其是对参与调节I/HPC的信号转导系统的研究，特别是丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号转导通路，已成为近年国内外低氧研究领域的热点。目前对M_APK的三条主要信号转导通路，细胞外信号调节激酶(ERKl/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和蛋白38激酶(p38)在脑FHPC中的作用已有广泛的研究。但是，对于MAPK信号转导通路下游重要底物：丝裂原和应激激活的蛋白激酶1(mitogen—and stress．activated protein kinasel，MSKl)和Ets样转录因子-1(Ets-liketranscription factor，Elk-1)在脑I/HPC发生发展过程中的作用尚未见相关报道。MAPK信号转导通路中，MSKl是ERKl/2和p38两条通路上的作用底物。MSKl是一些重要的转录因子，女HcAMP反应元件结合蛋白(CREB)和ATF等的上游激酶，可以使之磷酸化从而引起一些即早基因(IEGs)如c-fos，jun-B和egr-l等的转录。与MSK1信号通路略有不同的是，Hk-1是ERK1／2、JNK和p38等三条信号转导通路的作用底物。Hk-1是一种转录因子，激活后也可引起诸如c-fos和egr-1等即早基因的转录，这些基因的产物可以调节神经元在应激性损伤后的保护、再生、存活及修复等过程。因此，探讨MSK1和Elk-1在脑I／HPC发生发展过程中的作用，可进一步丰富人们对MAPK信号转导通路在脑I／HPC形成中作用的认识。本实验在室温18-22℃条件下进行，在已建立的自然低氧诱导的“小鼠整体HPC模型”基础上，将成年健康雄性BALB／c小鼠(12-14周，体重18-22克)随机分为正常对照组(H0)、低氧暴露1次(H1)、重复性低氧2-4次(低氧预适应早期，H2-H4)，以及重复性低氧5和6次(4次低氧小鼠恢复24h后，再进行第5、6次低氧刺激，即H5和H6为延迟性低氧预适应)等7组。以出现第一次喘式呼吸为低氧结束的指标，记录低氧耐受时间。在常氧环境下至少恢复30分钟再进行下一次低氧。低氧结束后，将小鼠处死，取前脑皮层和海马组织。实验用蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western-blot)等生化技术，并结合Gel Doc凝胶成像系统定量观察了早期和延迟性HPC小鼠大脑皮层和海马组织内MSK1及Elk-1的磷酸化水平和蛋白表达量的变化。此外，本实验还应用免疫组织化学方法从形态学上观察了HPC小鼠大脑皮层和海马组织内MSK1及Elk-1的磷酸化水平的变化及其在细胞内的分布情况。实验还应用免疫双标的方法确定了低氧刺激后MSK1和Elk-1发生磷酸化激活的细胞类型。所有实验数据均通过One Way ANOVA统计学检验，以均数±标准误表示(x±S.E.)，p<0.05有显著意义。实验结果如下： 1 实验发现，随着低氧次数的增多，小鼠低氧耐受时间增加。与只经过1次低氧预处理的H1组(18.0±1.8min，n=6)d、鼠相比，H2(32.8±3.4min，p<0.05，n=6)、H3(36.8±2.5min，p<0.05，11=6)和H4(38.5±1.9min，p<0.05，n=6)组等早期HPC小鼠的低氧耐受时间明显增高；而H5(21.5±2.9min，p<0.05，n=6)和H6(27.8±3.9min，p<0.05，n=6)等延迟性HPC组小鼠的低氧耐受时间虽然没有H2-H4组延长的那么明显，但与H1组比较，仍具有显著差异。 2定量分析HPC小鼠脑组织内MSK1和E1k-1磷酸化水平变化发现，在HPC早期的形成过程中，随低氧次数(H1-H4)或耐受时间的增加，小鼠海马和皮层组织内Thr645-MSK1(p-Thr645 MSK1)、Ser375-MSK(p-Ser375 MSK1)和Ser383-Elk-1(p-Ser383 Elk-1)磷酸化水平显著增高(p<0.05，每组n=6)；在延迟性低氧预适应(H5和H6)形成过程中，p-Thr645-MSK1、p-Ser375-MSK-1和p-Ser383 Elk-1水平也显著升高(p<0.05，n=6)。提示，MSK1和Elk-1的激活可能参与了脑早期和晚期HPC的发生发展过程。 3 定量分析HPC小鼠脑组织内MSK1及Elk-1蛋白表达量的变化时发现，无论在脑HPC早期形成(H1-H4)，还是在延迟性HPC(H5和H6)发展过程中，随低氧次数或耐受时间的增加，小鼠海马和皮层组织内MSK1及Elk-1蛋白表达量均无明显的改变。提示，MSK1和Elk-1并不以蛋白表达量改变的形式参与脑HPC的发生发展过程。 4 应用免疫组织化学方法发现，重复性低氧暴露后(H3和H6)，小鼠海马和大脑皮层组织内p-Thr645-MSK1、p-Ser375-MSK和p-Ser383-Elk-1阳性颗粒明显增加。这一形态学结果进一步支持了上述蛋白印迹结果，即MSK1和Elk-1的磷酸化水平在脑HPC发生发展过程中明显增高。 5 应用免疫双标法发现，重复性低氧刺激(H3)后，MSK1和Elk-1磷酸化水平升高主要发生在小鼠的海马和皮层的神经元内。 总之，本项工作为国际上首次对整体HPC小鼠脑组织内MSK1和Elk-1磷酸化水平和蛋白表达量的变化进行系统地探讨。研究结果表明，大脑皮层和海马组织神经元内MSK1和Elk-1的激活而非蛋白表达量的改变可能参与了小鼠脑HPC的发生发展过程。