马铃薯环腐病是严重危害马铃薯的病害之一,目前已经遍及了几乎所有的马铃薯产区。引起马铃薯环腐病的病原菌为密执安棒形杆菌环腐亚种(Clavibater michiganense subsp. sepedonicum (Spieckermann & Kotthoff) Davis et al.)。当前,人们主要利用化学杀菌剂对此病进行药物防治。由于化学杀菌剂本身固有的缺点,使其产生了环境污染、人畜中毒和农药残留等问题。植物在天然环境中可以形成大量的次生代谢产物来抵御植物病原菌。因此,以植物为材料的植物源杀菌剂受到了科研工作者们的广泛关注。然而,目前仍然没有有效抑制密执安棒形杆菌环腐亚种的植物源杀菌剂出现。本文以海带为主要材料研究其对密执安棒形杆菌环腐亚种的抑菌作用,主要的研究内容和结果如下：1.抑菌植物的筛选和海带抑菌物质提取工艺的优化30种植物的抑菌实验结果表明海带提取物相对于其他植物提取物具有最好且差异显著(P<0.05)的抑菌效果。通过八种溶剂的筛选,得到乙醇为海带抑菌物质提取的有效溶剂。分别进行提取温度、提取时间和提取比例三个因素的单因素实验。由单因素实验结果得出了正交实验因素的水平为,提取温度70℃、80℃、90℃；提取时间8h、10h、12h;提取比例1：20、1：25、1：30。正交实验的结果表明提取温度、提取温度与提取时间的交互作用显著(P<0.05)地影响海带乙醇提取物对密执安棒形杆菌环腐亚种的抑菌效果。海带抑菌物质的优化提取工艺为提取温度80℃、提取时间12h、提取比例1：25(g：mL)。2.海带乙醇提取物的性质测定海带乙醇提取物对密执安棒形杆菌环腐亚种的最低抑菌浓度为0.38mg/mL,最低杀菌浓度为0.75mg/mL。稳定性实验结果表明：在pH为5时,海带乙醇提取物具有最好且差异显著(P<0.05)的抑菌效果。提取物在紫外光下的抑菌活性稳定。Mn2+、Ba2+、Zn2+、Fe3+可增强提取物的抑菌活性,Ca2+可降低提取物的抑菌活性。3.海带抑菌成分的活性追踪和分析萃取实验结果表明,海带乙醇提取液的石油醚萃取物对密执安棒形杆菌环腐亚种有最强且差异显著(P<0.05)的抑菌效果。根据薄层层析(TLC)对海带石油醚萃取物的分离结果,得出石油醚／乙酸乙酯溶剂系统为柱层析的洗脱液。海带石油醚萃取物经过一级柱层析分离后,共得到19个流份。抑菌结果表明这19个流份均对密执安棒形杆菌环腐亚种有抑菌效果,其中流份3(Fr.3)与其他流份及石油醚萃取物相比,抑菌效果最好且有显著性差异(P<0.05)。二级柱层析结果表明,各次级流份的抑菌效果均显著(P<0.05)低于Fr.3的抑菌效果。因此对一级柱层析中分离得到抑菌效果最好的Fr.3进行进一步的气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析。结果得出Fr.3共计确认出了26种化合物,可以分为6类,其中包括11种烷烃类化合物、5种酯类化合物、5种有机酸类化合物、3种醇类化合物、1种酚类化合物和1种酸酐类化合物。所有组分中相对含量较高(4%)的有9种化合物,分别为：二十五烷(11.97%)、二十七烷(10.71%)、三十四烷(10.22%)、三十一烷(10.07%)、二十九烷(9.68%)、二十八烷(7.57%)、三十六烷(7.32%)、四十四烷(5.88%)和二十二烷(4.04%)。4.海带抑菌成分作用机理的研究设计了生长曲线测定实验、扫描电子显微镜(SEM)观察实验、透射电子显微镜(TEM)观察实验、细胞壁和细胞膜透性实验、菌体内活性氧(ROS)水平,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性测定实验、呼吸代谢影响实验、SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳实验、核酸影响实验。通过这八类实验对Fr.3作用于密执安棒形杆菌环腐亚种的抑菌机理进行了探讨。生长曲线的实验结果表明Fr.3主要作用于密执安棒形杆菌环腐亚种的对数期,通过抑制菌体的正常分裂来抑制菌体生长。采用扫描电镜和透射电镜观察密执安棒形杆菌环腐亚种的超微结构,Fr.3作用后的密执安棒形杆菌环腐亚种细胞壁损坏、细胞膜破损、细胞出现了肿胀、结团、质壁分离的现象,菌体内部出现了大小不一的空腔,一些受破坏严重的菌体被裂解成片状。分别检测菌体外碱性磷酸酶(AKP)活性和OD260nm值得出Fr.3对密执安棒形杆菌环腐亚种的细胞壁和细胞膜有破坏作用。流式细胞仪和荧光显微镜的检测结果表明Fr.3作用后的菌体,细胞膜出现了严重的去极化现象,菌体内Ca2+浓度有所上升。这个结果也证明了Fr.3作用下的密执安棒形杆菌环腐亚种的细胞膜受到了破坏。荧光分光光度计和紫外分光光度计的检测结果得出Fr.3能够使菌体内ROS显著性地积累、SOD和CAT活性降低。通过进行培养基溶氧测定实验、呼吸抑制率及叠加率测定实验、细胞内己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和总ATP酶(T-ATPase)活性测定实验,得出Fr.3通过抑制LDH、MDH和SDH活性来抑制糖酵解(EMP)途径和三羧酸(TCA)循环,使得呼吸作用减弱。SDS-PAGE的结果显示,Fr.3作用后菌体的总蛋白量不断减少。荧光分光光度计检测结果得出Fr.3能够明显地减少菌体内DNA和RNA的含量。琼脂糖凝胶电泳实验结果表明Fr.3可以直接作用于密执安棒形杆菌环腐亚种的基因组DNA。Fr.3作用后,基因组DNA的紫外光谱发生了明显的增色效应,说明由于Fr.3的作用,导致了DNA双螺旋的结构受到了破坏。Fr.3和溴化乙锭(EB)与基因组DNA的竞争性实验结果表明,Fr.3和EB竞争性地插入到DNA双螺旋的碱基对中,使得EB-DNA复合物的数量减少。流式细胞仪的分析结果表明由于Fr.3的作用,使得密执安棒形杆菌环腐亚种正常的细胞分裂周期发生了紊乱,细菌数目减少。总之,Fr.3中的抑菌物质通过不同位点的协同作用最终导致密执安棒形杆菌环腐亚种的死亡。5.海带乳油的配制和活体抑菌效果海带乳油的配方为：提取物浸膏(20%)、乙醇(10%)、吐温-80(4%)及水(66%)。海带乳油具有良好的稳定性和分散性。活体实验结果表明,海带乳油有较好的预防效果和治疗效果,说明海带乳油可以很好地防治密执安棒形杆菌环腐亚种对马铃薯的侵染。6.其他植物对密执安棒形杆菌环腐亚种的抑菌效果在所筛选的30种植物中,红蓼提取物和中华蹄盖蕨提取物的抑菌效果虽然略低于海带,却显著性(P<0.05)地高于其他植物提取物的抑菌效果。以红蓼和中华蹄盖蕨作为杀菌植物资源抑制密执安棒形杆菌环腐亚种,国内外尚未有报道。本文对红蓼叶和中华蹄盖蕨抑菌物质的提取工艺进行了优化,红蓼叶抑菌物质的优化提取工艺为提取时间6h、提取温度80℃、提取比例1：10(g：mL)。中华蹄盖蕨抑菌物质的优化提取工艺为提取比例1：20(g：mL)、提取温度97℃、提取时间10h。稳定性实验结果表明,在pH为5时,红蓼叶乙醇提取物具有最好且差异显著(P<0.05)的抑菌效果。在pH为2时,中华蹄盖蕨乙醇提取物具有最好且差异显著(P<0.05)的抑菌效果。红蓼叶和中华蹄盖蕨乙醇提取物在紫外光下的抑菌效果稳定。Zn2+、Fe3+可以增强红蓼叶和中华蹄盖蕨乙醇提取物的抑菌活性。实验结果表明,红蓼叶和中华蹄盖蕨乙醇提取物具有良好的环境稳定性。总之,本研究填补了国内外该领域的研究空白。为寻找和研究杀菌植物资源提供了科学依据,为抑制密执安棒形杆菌环腐亚种提供了新的途径。