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第一部分 rhBMP-6的表达、纯化与鉴定
骨形态发生蛋白(Bone morphogentic protein,BMP)属于TGF-β蛋白超家族(BMP-1缺乏碳段保守结构而除外)。BMP-6为BMP家族成员之一,与其它成员相比,BMP-6有较强的骨诱导作用。BMP-6在骨折愈合过程中表达上调,并在不同的骨缺损模型中,能加快缺损骨的修复。另外,系统给予BMP-6能有效治疗实验性骨质疏松引起的骨量减少和骨微观结构的改变,提示BMP-6对骨缺损和骨质疏松有潜在的治疗作用。本研究分别采用大肠杆菌和培养哺乳动物细胞为表达系统,通过基因工程途径获取具有生物活性的BMP-6蛋白。
1.BMP-6在大肠杆菌的表达、复性与纯化
以非融合形式分别在大肠杆菌胞质中表达不同截短模式,同时带有克隆位点引入氮端延伸序列(MA.或MG)的BMP-6单体蛋白或BMP-6突变体(Ala56-His)。表达菌株与表达条件筛选试验发现序列MA-BMP-6(1323)的表达量较高。因此选用MA-BMP-6(1323)在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达BMP-6成熟肽单体蛋白。
诱导表达后,BMP-6约占菌体总蛋白的20％,以包涵体形式存在。包涵体分离纯化后,获得组成均一的BMP-6单体蛋白。溶解试验发现高浓度变性剂(6MGdn-HCI)合并还原剂(0.1M DTT)能有效溶解包涵体蛋白。经溶解、折叠、添加剂试验逐步筛选、优化复性条件后,约10%蛋白形成同源二聚体。BMP-6突变体对二聚体的形成没有显著影响。复性所得二聚体蛋白能够通过反相色谱纯化。可能由于缺乏糖基化缘故,纯化的二聚体蛋白碱性磷酸酶诱导活性的量效关系不显著。
2.BMP-6在CHO细胞中的表达、纯化与鉴定
将含BMP-6信号肽、前肽和成熟肽以及含BMP-2信号肽、前肽与BMP-6成熟肽融合的基因序列分别克隆至哺乳动物细胞表达载体。利用脂质体瞬时转染分析发现BMP2/6融合基因能有效分泌表达BMP-6蛋白。
然后采用二氢叶酸还原酶(Dihydroflolate reductase,DHFR)缺失的中华仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)细胞为宿主,通过混合克隆、单克隆筛选以及目的基因扩增后,获得表达水平约20 ng/106 cells/24 h的稳定表达细胞株。对稳定表达细胞株的比生长速率,BMP-6的比生成速率与分泌特性,以及BMP-6在培养环境与条件培养基中的稳定性进行了初步研究。条件培养基中的BMP-6通过肝素亲和色谱与反相色谱分离纯化,对纯化产物的纯度和生物活性进行了鉴定。
最后,纯化产物剂量和时间依赖地诱导碱性磷酸酶活性。与对照相比,BMP-6在浓度为25 ng/ml时活性显著,在400 ng/ml时达到最大反应剂量,而半数有效量介于100-150 ng/ml。用50 ng/ml的BMP-6处理细胞三天,碱性磷酸酶活性与对照相比差异显著。
结论:本研究采用大肠杆菌表达系统,以非融合包涵体形式表达BMP-6单体蛋白,通过优化表达、体外氧化复性和纯化获得成熟肽二聚体;同时采用CHO细胞分泌表达BMP-6,通过载体优化、细胞株筛选、纯化流程建立等途径获取具有显著生物活性的BMP-6蛋白。
第二部分 BMP-6抗纤维化和氧化应激的作用与机制
除骨诱导作用外,BMP-6还参与机体发育和成体组织器官重塑过程的调节。研究发现慢性肾损伤时BMP-6表达下调,而慢性肾损伤直接抑制骨形成,提示抑制肾损伤可能能够促进骨形成。因此本文对BMP-6的抗肾纤维化以及抗氧化应激作用与机制进行研究。
1.BMP-6抑制TGF-β1诱导的PTEC转化
肾间质纤维化是慢性肾损伤的主要特征而TGF-β1在其中发挥重要作用。TGF-β1能诱导人近曲小管上皮细胞(Proximal tubular epithelial cell,PTEC)HK-2细胞增殖抑制、上皮间质转化和黏附性增加,能诱导Fibtonectin和TIMP-2(Tissueinhibitors of metalloproteinase-2)表达,而抑制MMP-2(Ma,trix metalloproteinase2)的表达和活性。同时,TGF-β1能激活Smad3和JNK激酶信号途径。BMP-6单独处理时,对HK-2细胞的增殖、形态表型、胞外基质蛋白的合成以及黏附性无明显影响。但是BMP-6能抑制TGF-β1诱导HK-2细胞增殖抑制,形态、表型转化,胞外基质蛋白的堆积以及黏附性增加,同时能抑制TGF-β1诱导的Smad3和JNK激酶的激活。本文研究证实BMP-6能抑制TGF-β1诱导的纤维化作用,这种作用可能是通过抑制JNK激酶和Smad3信号途径的活化而实现。
2.BMP-6通过Smad5途径诱导HO-1表达而抗PTEC氧化应激损伤
研究发现氧自由基参与TGF-β1诱导的PTEC转化而血红素氧合酶1(hemeoxygonase1,HO-1)是机体抗氧化应激的重要机制。BMP-6能剂量和时间依赖地抑制双氧水诱导的HK-2细胞氧化应激损伤,以及诱导HO-1表达。HO-1诱导、过表达以及HO-1产物胆红素或一氧化碳能减轻HK-2细胞的氧化应激损伤,而新基因合成抑制、HO-1活性抑制、HO-1基因干扰或一氧化碳捕获等能减弱BMP-6的抗氧化应激作用。BMP-6能激活Smad5途径,而Smad5基因干扰则抑制HO-1的诱导表达。HO-1启动子上Smad5结合位点缺失或突变能抑制BMP-6诱导的HO-1启动子活性增加。最终证实BMP-6通过Smad5途径诱导HO-1表达,通过HO-1的产物胆红素和一氧化碳来发挥抗氧化应激损伤作用。
结论:本研究在培养的肾近曲小管上皮细胞中发现,BMP-6能抑制TGF-β1诱导的肾近曲小管上皮细胞纤维化转变,并且能通过激活Smad5信号途径诱导HO-1表达而减轻肾近曲小管上皮细胞氧化应激损伤。这一结果为进一步深入研究BMP-6的骨生成和肾保护作用、机制与应用奠定了基础。