在药物分析中,样品处理在整个分析过程中起着关键性的作用,其主要目的是将待分析物从其基质中提取、分离出来,同时兼具纯化、富集的作用,从而达到提高准确性、特异性及灵敏度的目的。理想的分析样品处理方法一般要求其具有高的工作效率,即有好的提取分离效率,兼具纯化等作用,并且操作简单,处理步骤少,从而减少因多步处理而出现的污染与损失。因此,高灵敏度,快速,简便的样品处理方法成为了现今的一个研究热点。目前,最常用的样品处理方法大多为离线方法,如溶剂萃取、超声萃取、蛋白沉淀等传统技术。微萃取技术以其具有高选择性的萃取原理保证了良好的回收率与重现性,是一种有效的分析样品前处理方法,在近些年发展异常迅速。常用作前处理的方式主要有固相微萃取,液相微萃取;此外,微透析,超滤法等技术也是最常用的几种方法。在药物分析特别是生物药物分析中,大分子的分离或去除,往往是样品前处理的主要目的和关键步骤,其不但影响分析结果的准确度与精密度,而且是制约工作效率的关键;目前常使用的方法主要有各类沉淀离心法、凝胶渗透法以及透析技术等,然而这些技术大多存在耗时、操作步骤复杂、成本较高等不足之处。超滤技术是一种相对简便的样品前处理方法,但是传统的超滤装置所采用的膜一般都是平膜的形式,该种装置在超滤过程中会产生很大的浓差极化,间接导致膜渗流量下降和分离效率降低,滤液难于收集,同时昂贵的分析成本也使其难于普及。本课题采用了一种新型的中空纤维离心超滤技术,在离心超滤时离心力与中空纤维膜平行,离心力消除了膜表面的浓差极化现象,同时简化了有机溶剂提取或是加入沉淀剂时的繁琐、费时的步骤,避免了稀释作用,也降低了分析成本。分析样品前处理的另一重要任务是对分析目标的富集与浓缩,用以提高分析方法的灵敏度,特别是对于从硬件提高分析灵敏度有困难的分析技术,如毛细管电泳。传统的富集手段主要采用液液萃取、共沉淀等,近年来固相微萃取(SPME)、各类液液微萃取技术(LPME)以及顶空富集技术蓬勃发展,弥补了传统前处理技术的不足。然而,这些技术均属于离线的分离、富集技术,都存在着操作步骤繁琐、处理过程耗时、费用高等不足,因此,各类在线富集技术的研究与应用受到人们的日益关注。毛细管电泳(CE)是上世纪80年代发展起来的高效分离技术,但是,因其极小的进样体积以及较短的检测光程,使CE在微量及痕量组分的分离分析中受到很大的限制。虽然人们可通过采用特殊设计的检测池或应用高灵敏度的检测器提高检测灵敏度,但昂贵的仪器价格及对某些样品性质的特殊要求,限制了它的应用与普及。一个更可行、更合理的解决方法是样品的在线(或在柱)富集。这种方法是通过对样品、背景缓冲溶液的组成以及进样程序进行简单的调控而实现,无需对仪器进行改造。毛细管电泳场放大富集技术是毛细管在线富集技术的一种,其原理是是采用电迁移进样将低浓度的样品溶液加入到充有高浓度缓冲液的毛细管中。样品进入分离通道后,进样口端的预进溶液的电场强度大大高于毛细管内的电场强度,因此,开始时样品以高迁移速率运动,很快到达低电场强度的背景溶液中,此时迁移速率降低,样品离子在样品溶液和背景电解质交界处发生堆积而得到富集。本课题采用毛细管场放大在线富集的样品处理技术,对药品中微量毒性有效成分乌头碱、生物样品以及药物制剂中的微量成分进行了分析,为药物制剂的质量控制提供了可靠的方法。一、新型中空纤维离心超滤装置在样品处理中的应用(一)中空纤维离心超滤-HPLC法测定吲哚美辛脂质体包封率目的:利用大分子截留小分子通过的原理,采用新型中空纤维离心超滤装置,测定脂质体中未包封的小分子药物,从而计算脂质体的包封率。方法:取吲哚美辛脂质体约0.2 mL,置玻璃管中,将15 cm中空纤维弯成U型后插入该管,至离心机中,在4000 r/min条件下离心20 min,滤液直接注入色谱系统,测定游离药物浓度。另取吲哚美辛脂质体加甲醇破乳后分析测定总药物浓度,并计算包封率。色谱分析条件采用Hypersil C18 (150×4.6 mm,5μm)为色谱柱,以0.1 mol·L-1冰醋酸-乙腈(v/v=45:55)为流动相,检测波长为320 nm,流速为1.0 mL/min。结果:中空纤维离心超滤法能将脂质体和游离药物在平衡状态下快速分离,且脂质体和其他大分子物质不能通过中空纤维膜,而游离药物自由通过超滤膜,所获得的超滤液可以直接进行色谱分析,分析游离药物方法的过滤回收率大于97.0%。分析总药物方法的过滤回收率大于97.5%。相对标准偏差小于1.0%(n=5)。结论:采用中空纤维离心超滤法分析吲哚美辛脂质体的包封率,简单快速,可作为脂质体的质量控制方法。(二)新型中空纤维离心超滤装置进行样品前处理测定人体血浆中头孢克洛的含量目的:建立应用新的微型中空纤维离心超滤装置去除血浆中的大分子的样品前处理方法,研究克服蛋白结合对游离药物浓度影响的方法,并结合HPLC测定头孢克洛的血药浓度。方法:0.2 mL血浆经酸化后转移至自制玻璃离心管中,将中空纤维折成U型后,离心法20 min后,将所得滤液直接进样分析。采用Diamonsil(钻石)C18色谱柱(250×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈:四氢呋喃:10 mmol·L-1磷酸二氢钠水溶液(pH2.9)(6:5:89),流速为1.0 mL·min-1,内标为头孢拉定,在265 nm波长处检测。结果:在pH=2的条件下,血浆蛋白结合的药物基本释放,平均提取回收率不低于86.8%,平均方法回收率为99.2%。血药浓度在0.06-30.72μg·mL-1范围内线性关系良好(r=0.9996),最低检测限为0.02μg·mL-1,日内RSD均小于1.8%,日间RSD均小于3.6%。结论:该方法采用新型中空纤维离心超滤装置,仅通过调节pH后离心的一步操作就完成了样品处理过程,方法简便快速;同时避免溶剂稀释,提高了灵敏度;所得滤液纯净,可直接进样分析。适用于头孢克洛的临床药动学研究和血药浓度检测。二、毛细管电泳场放大富集技术检测骨刺消痛液中的乌头碱类毒性成分目的:建立毛细管电泳场放大富集技术测定骨刺消痛液中乌头碱类痕量毒性成分的方法。方法:取一定量样品经过酸化、乙醚脱脂溶性杂质、碱化,再用乙醚萃取后,氮吹,用10%乙腈复溶后,采用未涂层石英毛细管(50μm i.d.×50 cm,有效长度42 cm)为分离通道。电动进样,进样前预进水10 s,在进样30 s,进样电压12 kV。进样后在50 mmol·L-1磷酸二氢钠(pH=9)-乙腈(90:10)的运行缓冲溶液中运行,运行电压10 kV。紫外检测波长235 nm。结果:采用场放大在线富集技术,富集倍数达到500倍,乌头碱、次乌头碱分别在17.2~275 ng·mL-1和34.4~550 ng·mL-1,范围内线性关系良好,回收率大于93.9%,RSD小于3.8%。乌头碱和次乌头碱的最低检测限分别为5.7 ng·mL-1,7.1 ng·mL-1。结论:本法操作简便,灵敏度高,专属性强,富集倍数高,为骨刺消痛液中乌头碱类生物碱的限量检测提供一种新型的分析手段。