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背景:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种经典的全身性自身免疫性疾病,以大量自身抗体产生及炎性细胞因子失调为特征。目前SLE治疗药物疗效有限,病程迁延反复,故对其发病机理的研究显得尤为重要。SLE可由遗传、激素、环境等多因素共同致病,但其发病核心在于自身抗原暴露、免疫耐受缺失,从而导致体内免疫调控紊乱,包括T、B淋巴细胞活化增殖异常。而中性粒细胞作为启动固有免疫的一线细胞,早期研究发现其凋亡异常可参与SLE发病。近年来新发现的中性粒细胞死亡形式-中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs),因其形成过程释放大量自身抗原而参与SLE发病,但具体致病方式仍有待研究。有学者发现,体外诱导形成的NETs与免疫细胞共培养后可刺激Th17细胞及炎性介质的产生而参与多种自身免疫性疾病的发生。那么NETs能否引起T、B淋巴细胞异常而参与SLE发病过程呢?通过探讨SLE患者外周血T、B淋巴细胞活化水平与NETs水平的相关性,NETs对T、B淋巴细胞功能的影响,以及SLE患者体内NETs形成的相关信号通路,本研究拟初步阐明NETs在SLE中的免疫学致病机制,并为减少SLE患者体内NETs的形成寻找分子靶标,从而为SLE的治疗提供新思路。目的:1.分析SLE患者外周血T、B淋巴细胞活化水平及与NETs的相关性,以及NETs在体外能否引起T、B淋巴细胞活化、增殖及亚群改变,明确NETs在SLE中的免疫学致病机制。2.探究NETs形成过程中PI3K/Akt信号通路是否被活化,明确PI3K/Akt对SLE患者NETs形成的影响。方法:1.采集SLE患者及健康体检者空腹EDTA抗凝静脉血,流式细胞术检测全血中早期活化T细胞CD4+CD69+T、晚期活化T细胞CD4+HLA-DR+T和活化B细胞CD19+CD69+B的阳性表达率[即CD69+(%CD4+)T、HLA-DR+(%CD4+)T 和 CD69+(%CD19+)B]及活化标志在相应单个细胞上的平均表达量(即平均荧光强度,mean fluorescence intensity,MFI)。分离中性粒细胞,采用荧光光度法检测SLE患者外周血NETs水平,分析其与T、B淋巴细胞活化水平的相关性。2.分离10例健康体检者外周血中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)和单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)后,用 25nM 佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导 PMN4h形成NETs,与PBMC共培养24h后,流式细胞术检测如上述T、B淋巴细胞上活化指标的表达;共培养72h后,流式细胞术检测CD4+/CD8+T、CD38+(%CD19+)B细胞亚群的变化。同时,体外诱导形成的NETs与经细胞增殖染料CFSE标染的PBMC共培养72h后,流式细胞术检测PBMC的增殖水平。3.密度梯度离心法分离6例健康体检者外周血PMN后,在加入或不加入PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002或MK2206的情况下,荧光光度法检测经PMA及SLE患者混合血清分别处理PMN 90min和120min后NETs形成水平,分析NETs形成量的差异。结果:1.SLE患者体内淋巴细胞活化水平检测及与NETs的相关性:SLE患者组(58例)与HC组(36例)早期活化T细胞CD4+CD69+T占CD4+T的比例分别为[2.10%(1.10%,4.08%)VS 1.20%(0.80%,2.03%),P=0.001],单个细胞上 CD69 平均表达量(MFI)为[(105.72±47.32)VS(72.75± 13.65),P=0.000],两组间有显著差异,即SLE患者外周血T细胞早期活化水平明显高于对照组;SLE患者组(65例)与HC组(36例)相比,晚期活化T细胞CD4+HLA-DR+T 占CD4+T比例为[7.60%(5%,13.50%)VS 4.75%(3.43%,5.78%),P=0.000],及单个细胞上 HLA-DR 平均表达量(MFI)明显增加[(163.82±72.72)VS(99.97±26.21),P=0.000],即 SLE 患者外周血T细胞晚期活化水平显著升高。SLE患者组(58例)与HC组(36例)活化B 细胞CD19+CD69+B 占 CD19+B 的比例为[3.85%(1.70%,6.18%)VS 1.30%(1%,1.88%),P=0.000],单个细胞上 CD69 平均表达量(MFI)为[98(81.50,121)VS 66(58.50,73.25),P=0.000],两组间具有显著差异,即SLE患者外周血B细胞活化水平明显增加。此外,SLE患者外周血CD4+T淋巴细胞早期活化指标CD69在单个细胞上平均表达量(MFI)与NETs水平显著正相关[(r=0.42,P=0.026)],CD19+B淋巴细胞活化指标CD69在单个细胞上平均表达量(MFI)与NETs水平呈正相关关系[(r=0.45,P=0.024)]。2.体外实验检测NETs对T、B淋巴细胞活化的影响:分离10例健康体检者外周血PMN及PBMC,将体外PMA诱导生成的NETs与PBMC共培养24h后,与PMN组相比,NETs组CD69+(%CD4+)T增加[(81.41±15.48)%VS(1.99±1.30)%,P<0.001],单个CD4+T细胞上CD69 平均表达量(MFI)增多[(4663.50±2192.65)VS(93.70±46),P<0.001],表明NETs能诱导CD4+T细胞早期活化;HLA-DR+(%CD4+)T 在两组间无差异[(11.37±6.04)%VS(11.23±3.20)%,P=0.95],而相比PMN组,NETs组单个CD4+T细胞上HLA-DR平均表达量(MFI)增多[(3294.60±2789.37)VS(245.80±87.57),P<0.001],表明 NETs 能促进CD4+T细胞过表达HLA-DR。NETs组活化B细胞CD19+CD69+B占CD19+B比值为(57.58± 11.24)%,单个CD19+B细胞上CD69平均表达量(MFI)为(2268.90±571.79),而 PMN 组分别为(22.13±16.13)%和(247.60±96.70),两组间均有显著统计学差异(P<0.001),表明NETs能诱导CD19+B细胞活化。3.体外实验检测NETs对PBMC增殖的影响:分离10例健康体检者外周血PBMC及PMN,经细胞增殖荧光染料CFSE标染后的PBMC,荧光显微镜下观察发现PBMC染上绿色荧光,流式细胞术进一步检测到PBMC有较强荧光强度,表明PBMC成功标染上CFSE;将体外PMA诱导生成的NETs与经CFSE标染的PBMC共培养72h后,PBMC增殖水平在 NETs 组与 PMN 组间无差异[(184.40±76.47)VS(198.40±68.90),P=0.79],表明NETs在体外不能诱导PBMC增殖。4.体外实验检测NETs对T、B细胞亚群的影响:体外PMA诱导生成的NETs与PBMC共培养72h后,NETs组与PMN组间的CD4+/CD8+T比值无统计学差异[(1.76±0.38)VS(2.09±0.51),P=0.51],且 CD38+%(CD19+)B细胞比例在两组间也无差异[(74.11±4.86)%VS(73.31±7.19)%,P=0.82],表明 NETs 在体外不能引起 CD4+/CD8+T 比值改变及CD19+CD38+B亚群失调。5.NETs形成过程中PI3K/Akt的活化:分离6例健康体检者外周血PMN后,在PMA及SLE血清刺激PMN形成NETs过程中,加入PI3K抑制剂LY294002后,NETs生成水平明显降低[(310±182.77)VS(840.20±334.54),P=0.005]、[(419.33±196.83)VS(703±266.71),P=0.004];同样地,在加入Akt抑制剂MK2206后,NETs生成明显减少[(593±224.93)VS(842.60±307.04),P=0.007]、[(500.67±271.53)VS(784.50±348.28),P=0.009],组间均有统计学差异,表明 LY294002、MK2206能通过抑制PI3K/Akt活化而减少PMA及SLE血清刺激NETs形成。在PMN自发形成NETs的过程中,Akt抑制剂MK2206能抑制NETs形成[(138.67±52.11)VS(210.33±80.66),P=0.03],但 PI3K 抑制剂LY294002 无此作用[(168±78.08)VS(220.60±87.03),P=0.15],表明在PMN自发形成NETs的过程中,有活化Akt的参与,但其上游调控蛋白可能不是PI3K。结论:1.SLE患者外周血中T、B淋巴细胞活化水平增高,与NETs异常形成有关,表明NETs可能通过引起T、B淋巴细胞异常活化而参与SLE发病过程,揭示了中性粒细胞介导的固有免疫及淋巴细胞参与的适应性免疫可能在SLE发病过程中具有协同作用。2.NETs在体外不能促进PBMC增殖,但能引起T细胞和B细胞活化,表明NETs可能通过影响机体细胞免疫及体液免疫功能而参与SLE的发生发展。3.PMA及SLE混合血清可能通过PI3K/Akt信号通路启动了 NETs的生成,提示对PI3K/Akt信号分子的调控可能抑制NETs的产生,继而控制SLE的病理进程。