目的:通过建立Wnt5a过表达和沉默的根尖牙乳头干细胞(Stem cells from the apical papilla,SCAP)细胞系,检测其相关成骨及成脂因子的表达,探讨Wnt5a对SCAP体外成骨、成脂分化的影响,为Wnt5a调控SCAP的生物学作用提供一定的理论依据和实验基础。方法:通过体外酶消化法及有限稀释法纯化培养SCAP,并进行鉴定。构建Wnt5a过表达和沉默的慢病毒载体,稳定转染SCAP,获得Wnt5a过表达和沉默的SCAP细胞系,并以嘌呤霉素筛选;q RT-PCR检测SCAP中Wnt5a的m RNA表达,Western Blot检测Wnt5a的蛋白表达。将Wnt5a过表达SCAP和Wnt5a沉默SCAP以及各自的空载体对照组进行体外成骨诱导培养,分别在2周、3周和4周终止诱导,提取细胞RNA,q RT-PCR检测ALP、BSP、DSPP、OCN的m RNA表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测ALP、BSP、DSPP、OCN的蛋白表达。将Wnt5a过表达SCAP和Wnt5a沉默SCAP以及各自的空载体对照组进行体外成脂诱导培养2周,提取细胞RNA,q RT-PCR检测PPAR-γ的m RNA表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测PPAR-γ的蛋白表达。本实验相关数据均采用SPSS 19.0软件进行统计分析。结果:1.Wnt5a慢病毒稳定转染了SCAP,转染率近90%;Wnt5a过表达组与空载体组相比其m RNA及蛋白表达显著升高(P<0.05),Wnt5a沉默组显著降低(P<0.05)。建立了Wnt5a过表达和沉默的SCAP细胞系。2.SCAP成骨相关矿化因子的表达:(1)ALP:矿化诱导2周,Wnt5a过表达组与对照组比较,ALP的m RNA表达量降低(P<0.05),蛋白表达量升高(P<0.05);Wnt5a沉默组与对照组比较,ALP的m RNA表达量差异不明显(P>0.05),蛋白表达量降低(P<0.05)。诱导3周,与对照组相比,Wnt5a过表达组ALP的m RNA及蛋白表达量均升高(P<0.05),Wnt5a沉默组均降低(P<0.05)。诱导4周,与对照组相比,Wnt5a过表达组ALP的m RNA表达量升高(P<0.05),蛋白表达量差异不明显(P>0.05),Wnt5a沉默组m RNA及蛋白表达量均降低(P<0.05)。2、3、4周,Wnt5a过表达组m RNA及蛋白表达量均高于Wnt5a沉默组(P<0.05)。(2)BSP:矿化诱导2、3、4周,与对照组相比,Wnt5a过表达组BSP的m RNA及蛋白表达量均升高(P<0.05),Wnt5a沉默组均降低(P<0.05);Wnt5a过表达组BSP的m RNA及蛋白表达量均高于Wnt5a沉默组(P<0.05)。(3)DSPP:矿化诱导2周,Wnt5a过表达组与对照组比较,DSPP的m RNA及蛋白表达量均升高(P<0.05),Wnt5a沉默组与对照组比较,DSPP的m RNA表达量降低(P<0.05),但Wnt5a沉默组未检测到蛋白表达;Wnt5a过表达组DSPP的m RNA表达量高于沉默组(P<0.05)。诱导3周和4周,与对照组相比,Wnt5a过表达组DSPP的m RNA及蛋白表达量升高(P<0.05),Wnt5a沉默组降低(P<0.05);Wnt5a过表达组DSPP的m RNA及蛋白表达量均高于Wnt5a沉默组(P<0.05)。(4)OCN:矿化诱导2周,Wnt5a过表达组及沉默组与对照组比较,OCN的m RNA及蛋白表达量均升高(P<0.05);Wnt5a过表达组OCN的m RNA及蛋白表达均低于沉默组(P<0.05)。诱导3周及4周,Wnt5a过表达组OCN的m RNA及蛋白表达量高于对照组(P<0.05),Wnt5a沉默组低于对照组(P<0.05);Wnt5a过表达组OCN的m RNA及蛋白表达量均高于Wnt5a沉默组(P<0.05)。3.SCAP相关成脂因子PPAR-γ:与对照组相比,Wnt5a过表达组PPAR-γ的m RNA及蛋白表达量均升高(P<0.05),Wnt5a沉默组均降低(P<0.05),Wnt5a过表达组较Wnt5a沉默组表达量升高(P<0.05)。结论:1.成功建立了慢病毒稳定转染的Wnt5a过表达和沉默的SCAP细胞系,转染率近90%。2.Wnt5a过表达在体外能够上调SCAP细胞矿化因子ALP、BSP、DSPP、OCN表达,Wnt5a沉默则下调以上因子的表达,以矿化诱导3周及4周变化明显。3.Wnt5a过表达在体外能够上调SCAP细胞成脂因子PPAR-γ的表达,Wnt5a沉默则下调其表达。4.本研究条件下,初步证实Wnt5a对根尖牙乳头干细胞体外成骨、成脂分化具有促进作用;为牙根发育的分子机制和将来临床治疗及组织工程利用Wnt5a调控SCAP提供一定的的实验基础和理论依据。