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地方流行性牛白血病（Enzootic Bovine leukosis,EBL）是由牛白血病病毒（Bovine leukemia virus,BLV）引起的以淋巴细胞持续性增生为特征的传染性肿瘤性疾病,主要发生于4～8岁的成年牛。该病几乎遍布全世界各养牛国家,在我国某些牛群中血清阳性率达30%～50%,已成为牛的重要传染病之一。目前我国使用的牛白血病检测试剂几乎全部来自国外,价格昂贵,检测成本很高。因此自主研发高水平的检测试剂盒对该病的防制具有重要意义。本研究在原有的研究基础之上展开,将已构建并经鉴定正确的PET-32a-gp51表达菌株复苏,在大肠杆菌BL21中大量诱导表达,通过纯化及复性后得到纯度高、免疫学活性好的gp51重组蛋白,参照已建立的间接gp51-ELISA方法,以此重组蛋白研制了检测牛白血病病毒抗体的间接gp51-ELISA试剂盒,并进行了试剂盒的评价及初步应用研究。主要内容如下:1.gp51重组蛋白的大量制备与纯化将本实验室已构建成功的含PET-32a-gp51表达载体的菌株复苏,在大肠杆菌BL21中大量诱导表达,收集菌体经超声波破碎,将包涵体通过Ni2+亲和层析柱进行纯化,透析复性后用PAGE电泳检测,得到纯度较高的gp51重组蛋白。紫外光分光光度计检测,重组蛋白浓度为0.216mg/mL。2.试剂盒的制备及评价利用纯化的gp51重组蛋白作为包被抗原研制了gp51-ELISA诊断试剂盒,试剂盒主要成分包括:已包被抗原的96孔板、HRP标记的兔抗牛IgG和牛白血病阴性、阳性标准血清。对试剂盒进行了特异性、灵敏度、重复性及保存期试验,结果表明:试剂盒能特异地检测牛白血病阳性标准血清,与牛传染性鼻气管炎、蓝舌病、牛病毒性腹泻和赤羽病等阳性标准血清均无交叉反应;用该试剂盒对牛白血病阳性标准血清进行检测,测定效价为1:256～1:512,灵敏度是AGIDT的4～8倍;重复性试验,试剂盒批内差异为1.35%～4.11%,批间差异为3.49%～9.54%,分别小于10%和15%;保存期试验,试剂盒-20℃保存期为6个月,4℃保存期为1个月。与法国Synbiotics公司同类试剂盒进行比对试验,诊断敏感性、特异性和符合率分别为75%、96.1%和94.6%。3.试剂盒的初步应用对采集于山东济南的164份奶牛血清和进口澳大利亚奶牛的398份血清进行检测,BLV抗体阳性率分别6.10%和4.77%。试验结果表明,gp51-ELISA试剂盒具有特异性强、敏感性高、重复性好等特点,其检测效果与进口试剂盒相当,且价格低廉,可满足我国奶牛场、兽医站、屠宰场及口岸检疫EBL检测的实际需要,这为大范围调查我国EBL流行情况提供了一个较理想的工具。