目的：研究度他雄胺对大鼠附睾精子成熟和生育的影响，探讨度他雄胺抗雄性生育可能的作用机制，探索调节雄性生育的睾丸后作用靶点，初步建立附睾相关调节生育基因表达谱数据库。方法：1．使用度他雄胺20和40mg／kg／d大鼠灌胃给药，同时以氯丙二醇10mg／kg／d作为参照组，连续2周。给药结束后雄鼠与处于动情前期的雌鼠按2：1合笼，计算雌鼠的交配指数、受孕指数和生育指数，直接评价雄鼠生育力；采用计算机辅助精子分析系统分析大鼠附睾精子活力和形态，在此基础上合并使用透射电镜技术对各组附睾尾部精子进行透射电镜分析，评价度他雄胺对大鼠精子成熟的影响；采用SYBR-14和propidium iodide（PI）双重荧光染色计算精子存活率；采用Elisa法测定大鼠睾酮（testosterone, T）和双氢睾酮（dihydrotestosterone, DHT）血清浓度，评价度他雄胺对雄鼠雄激素水平的影响；采用精密电子天平对各组睾丸、附睾、前列腺和精囊进行称重，评价度他雄胺对大鼠生殖器官重量的影响；采用HE染色法对各组睾丸和附睾进行组织学分析，同时采用透射电镜技术对附睾上皮细胞超微结构进行分析，评价度他雄胺对大鼠主要生殖器官组织学的影响。2．采用差异贴壁分离、不锈钢过滤网过滤和添加DHT相结合的方法，进行大鼠附睾上皮细胞的原代分离培养；使用CCK-8试剂盒测定附睾上皮细胞的增殖活性，绘制细胞的生长曲线；使用角蛋白和波形蛋白抗体对附睾上皮细胞进行免疫细胞染色，以鉴定附睾上皮培养细胞的纯度。3．通过度他雄胺体外作用于附睾上皮细胞，采用不同给药浓度和作用时间，评价了度他雄胺对离体大鼠附睾上皮细胞活性的作用。具体使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测了不同药物浓度和作用时间下，附睾上皮细胞增殖活性的改变，通过测定光密度和抑制率，计算度他雄胺对附睾上皮细胞体外作用的IC₅₀；在此基础上使用硫代巴比妥酸和4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷法测定了度他雄胺对附睾上皮细胞分泌蛋白唾液酸和α-1，4糖苷酶活性的影响；使用透射电镜对药物作用后附睾上皮细胞的超微结构进行分析，评价度他雄胺对体外附睾上皮细胞形态功能的影响。4．使用Affymetix Genome Rat 230 2.0 Oligo-microarray对度他雄胺组、氯丙二醇组与正常大鼠附睾基因表达差异进行研究。具体采用Trizol对每组3个附睾（共9个）RNA分别进行抽提，并使用紫外定量与变性凝胶电泳质检，然后将各组RNA样本充分混合并纯化；使用Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit和Affymetrix GeneChip Sample Cleanup Module进行cDNA合成与纯化；使用GeneChipⅣT Labeling Kit和Genechip Sample Cleanup Module进行cRNA的合成、生物素标记和纯化；cRNA定量检测后，对其进行片段化处理（大小35-200bp）；接着在Genechip hybridization oven 640进行芯片杂交，16小时；洗脱、染色后，将芯片放入GeneChip Scanner 3000进行扫描，使用GeneChip operating software（GCOS）对扫描图像进行处理分析。各芯片探针信号经整体归一化（Global Normalization）后进行比较，根据信号表达强弱筛选出差异基因。使用Genespring GX 7.3.1和Fatigo+对差异基因进行进一步的功能分类。使用实时定量RT-PCR对部分差异基因进行验证，综合评价度他雄胺和氯丙二醇对大鼠附睾基因表达的影响。结果：1．度他雄胺低高剂量组血清DHT水平较阴性对照组（3.28nmol／L）均明显降低（P＜0.01），分别为0.54和0.28nmol／L（P＜0.01），而氯丙二醇组（3.13nmol／L）较阴性对照组则无显著差异（P＞0.05）；相应地，度他雄胺低高剂量组精子活率较阴性对照组（71.2％）亦明显降低，分别为39.0％和28.7％（P＜0.01），存活率下降为23.9％和21.5％（P＜0.05），畸形率分别增加为10.3％和15.6％（P＜0.05），最后受孕指数分别降为62.5％和38.4％，生育指数降为56.3％和31.3％，平均胎仔数降为8.7和6.2个（P＜0.05或0.01）。同时睾酮水平和交配指数均无明显变化（P＞0.05），HE染色提示睾丸和附睾亦无明显病理学改变；进一步的透射电镜分析表明度他雄胺高剂量组相当部分附睾上皮细胞有核染色质聚集和大量空泡形成，提示附睾上皮细胞有凋亡前兆。2．本实验共分离培养附睾上皮细胞13次，培养成功9次，培养成功率为69.2％；接着附睾上皮原代细胞共传代9次，成功5次，传代成功率为55.6％；最后对附睾上皮细胞进行的免疫细胞染色结果为附睾上皮细胞角蛋白染色胞浆呈棕色，波形蛋白染色阴性，纯度达95％以上，可以用于体外功能研究。3．度他雄胺对体外附睾上皮细胞的增殖活性和形态功能可产生影响，其中与附睾上皮细胞共培养48h时，度他雄胺的IC₅₀为16.1μg／ml，提示其具有较强的抑制附睾上皮细胞活性的作用；体外附睾功能蛋白活性测定显示度他雄胺可以抑制唾液酸的活性；进一步的透射电镜显示附睾上皮细胞有凋亡前兆，这与体内实验结果相吻合。4．使用Affymetix Rat Genome array 230 2.0芯片对度他雄胺高剂量组和正常对照组大鼠附睾基因表达差异进行了研究，在全基因组31042个转录子（transcripts or probe sets）中，根据detection p-value＜0.04为“Present”，正常对照组附睾共检测到17031个，占总数的54.8％，而度他雄胺组附睾共检测到18251个，占总数的58.7％。在此基础上根据GCOS data mining、GeneSpring和Fatigo+分析：相对于正常组，度他雄胺组附睾转录子表达显著变化的有1996个，占附睾转录子表达总数的10.9％，其中下调950个（Change p-value＞0.997），上调1046个（Change p-value＜0.0025），差异基因主要涉及大分子的代谢和转运、细胞信息交流、防御反应、受体活性、离子结合、细胞凋亡、水解酶和转移酶活性等基因。在进一步的差异基因功能分析中，筛选到度他雄胺下调的甾体激素代谢相关基因，它们的功能异常引起相关脂肪、蛋白和糖代谢的异常，进而可能引起附睾微环境的改变和精子成熟异常。另外度他雄胺组还筛选到较多上调的细胞凋亡正调控基因和下调的负调控基因，与前面度他雄胺在体和离体实验影响附睾形态功能的结果相一致，这可能是其抑制生育的一个重要原因。同时，在全基因组31099个转录子中，氯丙二醇组附睾共检测到17410个，占总数的56.0％相对于正常组，氯丙二醇组附睾基因表达显著变化的有169个，其中下调基因79个，上调基因90个，差异基因主要涉及大分子的代谢和转运、初级代谢过程、细胞代谢、生物学过程调控、免疫学调控、离子结合、水解酶和氧化还原酶活性等基因。进一步的差异基因功能分析发现氯丙二醇可以下调糖、脂肪、蛋白等物质和能量代谢基因，这与其传统抗生育理论相一致。结论：1．附睾尾部精子活力与度他雄胺对DHT的抑制水平之间存在相关性，即抑制水平越高，附睾尾部精子活力越低，进而雄鼠生育力也随之降低。度他雄胺通过抑制DHT水平，影响附睾精子成熟（活力和形态）而阻止精卵结合，最后达到抑制生育作用。同时度他雄胺组睾丸的各级精细胞梯度变化和组织学检查无异常，说明药物对睾丸精子和结构无影响。除此之外，本实验还发现度他雄胺高剂量组可以诱导部分附睾上皮细胞凋亡，这可能是由于附睾上皮细胞增殖高度依赖于DHT引起的，度他雄胺抑制DHT水平后，上皮细胞因缺少DHT调控而出现增殖抑制和凋亡前兆，进而影响其分泌吸收活性，导致附睾管微环境的改变，最后影响附睾精子成熟，这与度他雄胺诱导前列腺细胞凋亡治疗前列腺增生和前列腺癌的作用机理非常相似。本研究第一次报道了度他雄胺抑制生育的给药剂量、时间、评价方法和可能的作用机理，这将为今后附睾生育相关基因筛选提供一定的基础，为睾丸后调节生育新作用靶点的发现提供工具和方法，为新型男用避孕和抗不育药物研发提供思路和启示。2．虽然对大鼠附睾上皮细胞成功进行了分离纯化和原代培养，但由于整个操作过程的复杂性、间质细胞的干扰性、贴壁分离的不确定性和细胞传代的有限系性，所以重复性较低，使原代附睾上皮细胞的体外药物筛选和研究遇到一定的限制。希望今后可以结合使用其它方法如渗透性支持培养等进行更多的尝试，以找到附睾上皮细胞原代培养更好的方法。3．在附睾上皮细胞原代培养成功的基础上，研究了度他雄胺对体外附睾上皮细胞活性和形态功能的影响，结果表明度他雄胺对其活性有较强的抑制作用；对附睾功能标志蛋白唾液酸活性的影响，则提示其可能通过影响附睾分泌蛋白和精子成熟；另外药物作用后的上皮细胞出现凋亡前兆，说明在保证上皮细胞各细胞器形态功能完整的情况下，度他雄胺可能通过诱导上皮细胞凋亡影响其分泌吸收活性，进而干扰附睾微环境和精子成熟，最后抑制精卵结合和雄性生育。4．对度他雄胺和氯丙二醇诱导的不育大鼠附睾基因表达差异进行了研究，从中筛选出部分差异基因，对这些基因进行功能分类后，初步建立了附睾调节生育相关基因表达谱数据库，对这些基因的进一步筛选和功能研究，将为附睾调节生育提供新的作用靶点，为新型调节生育药物的研发提供一定的理论和实践基础。