1.立题背景白血病是严重威胁人类健康与生命的造血系统的恶性肿瘤,流行病学调查显示,其在儿童和39岁以下癌症患者中的死亡率一直居于首位。白血病的发病机制是一个多因素作用的多阶段过程,同时不同类型的白血病其发病机制不尽相同。非随机染色体易位、造血相关的原癌基因或抑癌基因突变是人类白血病的重要发病机制之一,造血相关的转录因子、细胞因子网络异常可以促进白血病的发展进程。随着现代分子生物学技术的快速发展,白血病发生的分子机制将得到进一步的阐明。维甲酸类化合物为代表的诱导分化疗法已经成功的应用于白血病的治疗,其在体内作为维甲酸受体(RAR)或维甲酸X受体(RXR)的配体而发挥抗肿瘤作用,具有诱导肿瘤细胞分化、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖等作用。目前,维甲酸类化合物已成为治疗白血病的主要药物之一,如ATRA用于治疗APL的有效缓解率可达70～80%。但是目前常用的维甲酸类药物在临床应用中常出现耐药现象而造成白血病治疗的失败,亟需发展新型维甲酸类药物解决其这一缺点。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是参入调控基因转录的关键因子之一,组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)已被证明对一些类型的白血.病和其他癌症具有确切的治疗效果,其抗白血病作用有多种机制,包括阻滞细胞周期进展、促进细胞分化、诱导细胞凋亡、抑制血管生成和诱导肿瘤免疫等。一氧化氮(NO)是一个重要的细胞信使分子,参与体内众多生理过程的调节,包括血管舒张、神经信号传递和参入免疫反应等。研究发现NO在肿瘤免疫过程中扮演重要角色,其在合适浓度条件下具有肿瘤细胞毒性以及诱导抗肿瘤细胞凋亡的活性,并且可以阻止肿瘤细胞转移和有效的克服传统化疗药物的耐药现象。一氧化氮供体(NOdonors)作为NO的外源性来源,其为NO用于疾病治疗提供了一个可靠的途径,其中部分一氧化氮供体化合物显示了显著的抗白血病活性,而可望作为先导化合物发展新型的抗白血病药物。多靶点药物设计是药物设计和发现领域的重要策略,多靶点药物可以直接或者通过其代谢产物间接作用于多种不同的生理靶点而发挥协同治疗作用,产生更佳的治疗效果、更少的毒副作用和更低的耐药性,尤其适合于治疗涉及多病理过程的复杂性疾病,如癌症、心血管疾病和神经退化性疾病等。通常,多靶点药物可以通过偶联药效团法进行设计,即通过可裂解或者不能裂解的连接基团将两个不同的药效团或者药物连接成一个药物分子。另外一种方法是合并药效团法,它是通过将两个不同药效团或者药物分子的相同结构部分进行重叠而得到一个更简单的药物分子。2.目标化合物的合理药物设计传统多靶点疗法如联合化疗等是多靶点药物开发的重要基础,研究显示,RAR配体与RXR配体联合使用具有协同作用,可以提高其对肿瘤细胞的抑制增殖、诱导凋亡和诱导分化活性；RAR激动剂如ATRA等与HDAC抑制剂如丁酸、丙戊酸、SAHA、FK228、MS-275及TSA等联合用药可以提高其对APL等急性白血病的疗效并减少其毒副作用等,尤其可以消除白血病患者对维甲酸类化合物的耐药性；另外,维甲酸类化合物如ATRA等与其他一些抗肿瘤药如As203、顺铂等联合用药也具有协同作用,而提高其治疗白血病或实体肿留的效果。本文研究在大量文献调研的基础上,在多靶点药物理论指导下,采用组合药效团法设计了4个系列共52个全新结构的新型多靶点化合物,其中选取具有诱导分化作用的RARα选择性激动剂他米巴罗汀(AM80)作为基本模型药物,其通过各种连接单元如二醇、二胺、乙醇胺和各种氨基酸等分别与N,N-二甲基乙醇胺、RXR配体、HDAC抑制剂、Furoxan型NO供体等连接形成多靶点抗肿瘤衍生物。通过这些新型多靶点化合物,我们期望筛选出疗效更佳、毒副作用更低的抗白血病新药。3.目标化合物的化学合成本文研究合成了4个系列共52个全新结构的目标化合物、4个模型药物和72个主要中间体化合物,目标化合物、模型药物和具有全新结构的中间体化合物采用1H-NMR, ESI-MS, HR-MS和IR谱进行了结构确证。本文参考相关文献合成了4种模型药物：他米巴罗汀(AM80)、贝沙罗汀(LGD1069)、4-[(5,6,7,8-四氢-3,5,5,8,8-五甲基-2-萘基)羰基]苯甲酸(LG)和丙戊酸(VPA),并进行了工艺改进。AM80-DMEA系列衍生物的合成是以RARα激动剂AM80作为起始原料,通过酯化反应与胆碱前体DMEA相拼合,然后通过其中DMEA部分的叔胺结构再与各种无机酸或有机酸成盐而制得一系列水溶性目标化合物；AM80-HDACI系列衍生物以HDAC抑制剂正丁酸和丙戊酸作为起始原料,其首先转化为酰氯,然后通过酰化反应与各种二醇、二胺、醇胺等进行单基团连接,最后与AM80进行缩合反应制得一系列目标化合物；AM80-RXR激动剂系列衍生物以RXR激动剂贝沙罗汀(LGD1069)和4-[(5,6,7,8-四氢-3,5,5,8,8-五甲基-2-萘基)羰基]苯甲酸(LG)为起始原料,其通过缩合反应与各种二醇、二胺、醇胺等进行单基团连接,然后再与AM80进行缩合反应制得一系列目标化合物；AM80-NO供体系列衍生物是以苯甲醛为起始原料,经Claisen-Schmidt缩合反应、NaBH4还原、亚硝化反应制得Furoxan型NO供体化合物3-羟甲基-4-苯基-1,2,5-(?)二唑-2-氧化物,然后经氯代反应、醚化反应、水解反应、酯化反应制得多种反应中间体,再与AM80或者AM80的二醇/二酚/二胺/醇胺的单基团酰化衍生物中间体进行缩合反应而制得一系列目标化合物。4.目标化合物的生物活性评价本研究设计合成的52个目标化合物采用人类白血病HL-60、NB4和K562细胞株进行了细胞水平的药效学筛选；2个代表性的目标化合物21d和51p采用NOD-SCID重症联合免疫缺陷小鼠进行了动物水平的初步药效学评价；1个代表性的目标化合物21d进行了Wistar大鼠体内的初步药物动力学研究；另外本文采用多种实验方法评价了代表性目标化合物的代谢特性,包括AM80-NO供体系列衍生物的体外NO释放实验,3个代表性目标化合物31q、41p、53f在大鼠肝微粒体孵育体系中的体外代谢试验等。细胞增殖抑制实验结果显示,AM80-DMEA系列衍生物中多数目标化合物对人白血病HL-60、NB4和K562细胞株的增殖抑制活性优于阳性对照药AM80,其中化合物21d、21e、21f对HL-60细胞的增殖抑制活性分别比阳性对照药AM80强40倍、60倍和50倍,显示了良好的成药潜力；AM80-HDACI系列衍生物中,化合物31s对人白血病HL-60、NB4和K562细胞株的增殖抑制活性明显优于阳性对照药AM80,化合物31n对HL-60和K562细胞的增殖抑制活性优于AM80,化合物31m和31u对K562细胞的增殖抑制活性优于AM80；AM80-RXR激动剂系列衍生物中,多数目标化合物对HL-60、NB4和K562细胞株的增殖抑制活性劣于阳性对照药AM80,只有化合物41m对HL-60和K562细胞的增殖抑制活性略强于AM80；AM80-NO供体系列衍生物中,所有目标化合物对急性白血病HL-60和NB4细胞株的增殖抑制活性明显优于对慢性白血.病K562细胞株的活性。化合物51v、52p、52s、52t、53f、53g对急性白血病HL-60和NB4细胞的增殖抑制活性明显优于阳性对照药AM80,而化合物51v、52p、52t、53f对慢性白血病K562细胞的增殖抑制活性明显优于AM80,尤其地,化合物52p对白血病细胞株的增殖抑制活性最强,其对HL-60、NB4和K562细胞株的半数抑制浓度(IC50)分别为0.16μM、0.19μM和7.12μM,分别比AM80对这3种细胞株的抑制活性强56倍、25倍和6倍。总体而言,本系列化合物中对3种白血病细胞具有较好生物活性的化合物的比例超过总数的50%,说明将RAR激动剂与NO供体杂合而成的多靶点化合物可能具有更好的抗白血病活性。NOD-SCID小鼠药效学研究结果显示,代表性目标化合物21d和5 1p对NOD-SCID小鼠-人白血病模型的治疗效果与阳性对照药物AM80相近,而化合物21d与AM80相比具有更好的水溶性和更低的皮肤刺激性,可以制成注射剂型来提高生物利用度,可望作为me-too新药进行深入开发。Wistar大鼠体内药物动力学实验结果显示,代表性目标化合物21d口服给药后较AM80更容易吸收,其注射给药后可在体内完全代谢,释放出原药AM80和DMEA而发挥协同治疗作用。大鼠肝微粒体体外代谢实验结果显示,目标化合物31q、41p、53f在大鼠肝微粒体孵育体系中都发生了明显的代谢降解反应,3种化合物的主要代谢产物都是AM80,说明其主要代谢反应都是水解反应；一氧化氮释放实验结果显示,AM80-NO供体系列衍生物在含3.1mmol·L-1 L-cys的PBS溶液中都可以明显的释放一氧化氮,各种氨基酸作为连接基团的目标化合物52p-52t具有相对较大的NO释放百分率。5.结论综上所述,本研究以多靶点药物理论为指导,采用组合药效团法设计和合成了4个系列全新结构的抗白血病多靶点化合物,并对这些化合物进行了初步的生物活性评价和构效关系研究,结果发现10多个目标化合物对人类白血病细胞的增殖抑制活性优于阳性对照药AM80。这些结果对于进一步开发新型抗白血病多靶点药物具有重要的意义。