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研究背景和目的鼻咽癌虽属于放射敏感型肿瘤,放射治疗极大地改善了鼻咽癌患者的局部控制率和远处转移率。然而,由于鼻咽癌发生、发展的分子机制尚未完全清楚,目前中晚期鼻咽癌治疗失败的主要原因仍然是局部复发及远处转移。研究表明,鼻咽癌患者体内存在多种miRNA的异常表达,并且参与了鼻咽癌的发生、发展过程。miR-124-3p在许多肿瘤中具有抑癌作用,然而其机制目前仍不明确。在本实验中我们将探讨miR-124-3p的生物学功能和作用机制,探索miR-124-3p调控的靶基因以及通过何种机制发挥抑癌作用,该问题的阐明将进一步加深对鼻咽癌发病机制的理解。研究方法和结果1.采用qPCR法检测miR-124-3p在鼻咽癌细胞株中的表达。结果发现:miR-124-3p在鼻咽癌细胞株中表达均显著下调。2.采用原位杂交的技术,检测miR-124-3p在鼻咽癌组织中的表达。发现miR-124-3p在鼻咽癌组织中表达显著下调。结合临床资料分析,结果发现:miR-124-3p表达与年龄、性别、T分期、N分期、临床分期无明显相关。生存曲线表明:miR-124-3p高表达组预后明显好于低表达组。回归分析表明:miR-124-3p表达和临床分期是总生存率的独立预测因素;临床分期是无复发生存率的独立预测因素。3.使用CCK8和克隆实验检测miR-124-3p表达对鼻咽癌细胞增殖和克隆的影响。结果发现:过表达miR-124-3p细胞株的增殖明显被抑制,克隆数目也显著减少。而敲低miR-124-3p表达后的细胞株增殖速度显著增快,克隆数目也明显增多。通过Western blotting检测发现在miR-124-3p过表达的鼻咽癌细胞株中,细胞周期蛋白cyclin D3和CDK4蛋白水平明显降低。而在miR-124-3p低表达的鼻咽癌细胞株中,细胞周期蛋白cyclin D3和CDK4蛋白水平是升高的。4.裸鼠皮下成瘤实验表明:相比对照组,miR-124-3p过表达的实验组生成的肿瘤肉眼观明显更小。实验组的肿瘤的体积、平均肿瘤重量均小于对照组。经qRT-PCR检测,结果显示:实验组皮下瘤组织中miR-124-3p的表达水平较对照组增高。5.使用数据库查询到miR-124-3p高度靶向PCDH8的3’-UTR区,推测PCDH8是miR-124-3p的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验证实。6.miR-124-3p正向调控PCDH8的表达:qRT-PCR检测结果显示,当过表达miR-124-3p后,PCDH8 mRNA表达水平显著上调;而在敲低miR-124-3p表达后,PCDH8 mRNA表达水平也显著下调。Western blotting结果显示,当过表达miR-124-3p后,PCDH8蛋白水平显著增高;而在敲低miR-124-3p表达后,PCDH8蛋白水平也显著降低。在裸鼠皮下成瘤实验中,miR-124-3p过表达的实验组皮下瘤组织中PCDH8蛋白水平明显增高。7.PCDH8逆转了 miR-124-3p inhibitor促进的鼻咽癌细胞增殖:CCK8实验发现,加入miR-124-3p抑制剂后,miR-124-3p inhibitor+vector组细胞增殖能力提高。进一步转染PCDH8质粒后,miR-124-3p inhibitor+PCDH8组细胞的增殖能力相比 miR-124-3p inhibitor+vector 组显著下降。8.PCDH8逆转了 miR-124-3p inhibitor促进的鼻咽癌细胞克隆形成克隆:平板克隆实验表明,miR-124-3p inhibitor+PCDH8组细胞克隆集落数显著小于miR-124-3p inhibitor+vector组。9.采用免疫组化方法,检测PCDH8在鼻咽癌组织中的表达,结合临床资料分析。结果发现:PCDH8表达与年龄、性别、T分期、N分期、临床分期均无明显相关。生存曲线表明:PCDH8高表达组预后明显好于低表达组。回归分析表明:临床分期是总生存率和无复发生存率的独立预测因素;PCDH8表达不是总生存率和无复发生存率的预测因素。10.miR-124-3p表达上调或低表达导致PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的蛋白水平的相应的上升或下降。结论1.miR-124-3p在鼻咽癌细胞株和组织中低表达,并且miR-124-3p高表达的鼻咽癌患者的预后较好。2.在体外和体内功能实验,miR-124-3p的过表达抑制鼻咽癌细胞的增殖能力。3.PCDH8介导了 miR-124-3p抑制鼻咽癌细胞增殖的作用。4.miR-124-3p通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制鼻咽癌细胞的增殖。