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真菌活性次级代谢产物一直是新药开发的重要来源,目前很多真菌来源的化合物及其衍生物已经是市场上销售的药品。橘青霉作为降血脂药物美伐他汀的产生菌,引起了科研人员的广泛关注。目前已从橘青霉中分离得到约200种次级代谢产物,其中包括呋喃酮类、喹啉类、吡咯烷生物碱类等,这表明橘青霉产生次级代谢产物的能力强大。橘青霉的次级代谢产物中不乏生物活性显著的化合物,但目前仅对美伐他汀和橘霉素的生物合成基因簇有详细的分析。对橘青霉进行全基因组测序,解析橘青霉次级代谢产物基因簇,对于靶向地挖掘橘青霉的活性次级代谢产物有重要意义。真菌天然产物中有一类化合物被称为非核糖体肽类化合物。非核糖体多肽类是自然界中经由非核糖体肽合成途径,在非核糖体肽合成酶的作用下合成的一系列结构复杂种类繁多的化合物。非核糖体肽合成酶是一类多功能蛋白复合体,能识别、激活转运氨基酸底物按特定顺序合成非核糖体肽。根据非核糖体肽合成酶的结构可将其分为单模块非核糖体肽合成酶和多模块非核糖体肽合成酶。单模块合成酶的结构较为简单,通常缺失缩合结构域,且在真菌中非常保守。目前已知的真菌单模块非核糖体肽合成酶有两种类型（NRPS:A-T-TE和NRPS:A-T-R）,它们的生物合成产物均有一定的生物活性。本课题通过对橘青霉ATCC38065的基因组分析,探索橘青霉ATCC38065中是否存在NRPS:A-T-R-R类型的单模块非核糖体肽合成酶,并通过分子生物学手段挖掘其代谢产物。目的:对橘青霉ATCC38065进行全基因组测序,解析次级代谢产物相关基因簇;建立橘青霉ATCC38065基于原生质体转化的遗传转化体系,对橘青霉ATCC38065单模块非核糖体肽基因产物进行靶向挖掘。方法:1.提取橘青霉ATCC38065基因组,测序后利用软件对序列进行组装并预测基因,将所有基因归类;将全基因组序列上传至fungalSMASH预测其次级代谢产物基因簇,并获取次级代谢相关蛋白序列,通过Blastp解析每个基因簇可能参与次级代谢合成的基因功能。2.挖掘特殊NRPS基因簇;用挖掘到的NRPS:A-T-R-R氨基酸序列,与其他菌株的基因组进行本地Blast对比,考察NRPS:A-T-R-R存在的广泛性并做进化树分析;通过Blast比对确定NRPS:A-T-R-R中A结构域和两个R结构的范围,并作进化树分析。3.通过对孢子萌发时间、溶壁酶配比、酶解时间这三个重要实验条件的探索,向原生质体中导入抗性质粒,对转化子进行抗性筛选并作基因组验证,建立橘青霉ATCC38065基于原生质体转化的遗传转化体系。4.通过RT-PCR探究橘青霉ATCC38065中NRPS:A-T-R-R所在基因簇中调控基因tf与骨架基因atrr的表达情况;通过构建过表达载体,并对橘青霉ATCC38065进行遗传转化,用潮霉素B进行初筛,以期得到相应的过表达菌株;高效液相检测橘青霉ATCC38065 tf与atrr过表达转化子的次级代谢产物;通过制备液相分离转化子所产生的代谢产物,并利用质谱和核磁检测对其进行结构鉴定;通过基因组验证及RT-qPCR验证橘青霉ATCC38065转化株中tf与atrr的表达情况。5.构建橘青霉ATCC38065 atrr在构巢曲霉中的异源表达质粒,将质粒导入构巢曲霉中并发酵检测产物。结果:1.橘青霉ATCC38065全基因组序列大小为31.34Mb,GC含量为48.26%,共包含17473个基因。橘青霉ATCC38065次级代谢产物基因簇预测确定橘青霉ATCC38065中共含有119个次级代谢产物基因簇,其中有10个非核糖体肽合成基因簇、15个聚酮合成基因簇、6个聚酮与非核糖体肽杂合化合物合成基因簇、4个萜类合成基因簇,84个其他类型的基因簇,并分析得到了各基因簇中次级代谢相关基因的功能。2.在橘青霉ATCC38065基因簇中发现了编码特殊单模块NRPS:A-T-R-R蛋白的基因序列,且此基因也存在于其他青霉或曲霉之中;通过蛋白质序列比对以及进化树分析发现,NRPS:A-T-R-R蛋白序列在本实验室保存的众多青霉属和曲霉属的菌株中均相当保守,NRPS:A-T-R-R中A结构域明显区别于其他单模块非核糖体肽合成酶（NRPS:A-T-TE和NRPS:A-T-R类型）中的A结构域,NRPS:A-T-R-R中第一个R结构域与PKS和PKS-NRPS中R结构域相似度较高,但第二个R结构域与对比的其他R结构域均有明显差异。3.成功构建了橘青霉ATCC38065的原生质体介导的遗传转化体系,确定橘青霉孢子最佳萌发时间为16.5h,在含Lysing enzyme 3mg/mL与Yatalase 2mg/mL酶解液中酶解12h时转化效果最佳。4.提取橘青霉ATCC38065野生型RNA后RT-PCR扩增验证表明tf与atrr有表达;得到橘青霉ATCC38065 tf与atrr过表达的转化子P.citrinum OE::tf、P.citrinum OE::atrr;P.citrinum OE::tf转化子代谢谱与野生型无差异,P.citrinum OE::atrr代谢谱中有一个化合物峰增高,将该化合物命名为化合物A,后鉴定结果确定其为（4E）-4-[（4-羟基-3-甲基-2-丁烯基）氧基]苯甲酸,它的产量是野生型中11.7倍;RT-qPCR验证表明P.citrinum OE::tf中tf与atrr的表达量分别为野生型的4.0倍和7.2倍,P.citrinum OE::atrr中atrr的表达量是野生型的8.8倍;5.获得A.nidulans::P.citrinum atrr转化子,HPLC检测结果表明其代谢谱相较野生型有新的次级代谢产物产生。结论:对橘青霉ATCC38065进行基因组测序,获得橘青霉ATCC38065全基因组序列。橘青霉ATCC38065基因组中中共含有119个次级代谢产物基因簇,其中仅pks10产生已知化合物美伐他汀,大量基因簇的获得为挖掘橘青霉ATCC38065次级代谢产物合成基因簇的生物合成产物提供重要依据。本课题建立了橘青霉ATCC38065 CaCl2-PEG介导的原生质体转化体系,使得橘青霉ATCC38065的基因操作变得更为便捷,有利于对橘青霉ATCC38065基因组的进一步挖掘。本课题实现了NRPS:A-T-R-R在构巢曲霉中的异源表达,有望获得该基因簇的合成产物结构,丰富真菌次级代谢产物类型。