茶树菇多糖与鼠李糖乳杆菌协同抗衰老作用研究

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茶树菇是营养丰富的食用菌,其多糖具有抗氧化和延缓衰老的作用;鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus GG)作为有益菌能够增强机体免疫、改善胃肠道功能,延缓机体衰老的过程。茶树菇多糖的抗氧化作用,可以有效防止LGG被活性氧抑制,并且提供碳源促进LGG生长,同时作为益生元能够增加益生菌的增殖,从而更好的调节胃肠道功能。本研究在实验室前期工作的基础上,结合经典的细胞实验,通过茶树菇多糖(APS)和LGG干预的过氧化氢(H2O2)损伤模型对细胞的生长、凋亡的影响以及衰老相关基因的分子水平分析;联合D-半乳糖致衰老小鼠模型的行为观察、学习记忆的影响以及血常规、肝脏的病理学分析,肠道代谢物的分析等。探讨APS和LGG体内外抗衰老活性,为APS和LGG抗衰老营养与功能性食品的研发提供理论基础。1.构建H2O2诱导的人胚肺成纤维细胞(MRC-5)衰老模型,探究APS和LGG延缓衰老的作用。结果发现APS和LGG均能维持细胞活力,减少细胞凋亡,提高细胞的抗氧化能力以及延缓线粒体膜电位的破坏,且APS+LGG组的效果比单独组显著(P<0.05)。RT-qPCR和蛋白免疫印迹分析指出,Klotho、Nampt、Prx1和Sirt1 mRNA相对表达量整体趋势类似。尤其是H2O2组与其他组相比,mRNA和蛋白相对表达量明显减少。而Sirt1基因的蛋白表达出现下调趋势,说明样品组对该基因下调不显著(P>0.05)。白藜芦醇组、APS和LGG组对mRNA水平的表达量均呈上调趋势;其中APS+LGG组下调的效果比单独组显著(P<0.05)。p16和p21的模型组与空白组相比,蛋白相对表达量显著增加(P<0.05),但p53的效果较差。在样品组中,p16和p53均呈下调趋势,而p21基因中蛋白表达水平呈上调趋势,说明样品对该基因的蛋白表达效果不理想。2.构建D-半乳糖致衰老小鼠模型,探究APS和LGG对衰老小鼠的行为观察和学习记忆的影响。研究结果表明,模型组小鼠进食量明显减少,体重缓慢增加,精神萎靡,嗜睡,皮毛晦暗无光泽,易脱落,呈现明显的衰老特征。治疗组在穿越平台次数和停留在目标象限的总时间均要比模型组高,且APS+LGG的效果比单独食用效果更好;衰老组小鼠逃避潜伏期和游泳速度等方面较差,药物组作用不显著(P>0.05),但总体呈现减少的趋势。此外,模型组小鼠海马中BDNF的阳性细胞、光密度、分布密度和目标面积的表达与其他组比均显著降低(P<0.05),说明APS和LGG能较好的增强小鼠的记忆能力,延缓衰老的效果。3.通过D-半乳糖皮下注射建立小鼠衰老模型,探究APS和LGG对衰老小鼠的饮食干预。试验结果显示,APS和LGG能较好的影响小鼠的白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)和血小板(PLT)的含量,对总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)等体内抗氧化指标具有显著影响(P<0.05);此外,APS+LGG组中雄性小鼠的T-AOC、CAT和SOD水平和雌性小鼠的CAT、GSH-Px和MDA水平与单独组比均改善效果更加显著(P<0.05),尤其是肝脏的病理切片观察,发现饮食干预能很好的改善病变的肝脏,对抗氧化抗衰老起到一定的防御作用。4.16S rRNA基因高通量测序技术研究APS与LGG对D-半乳糖致衰老小鼠肠道菌群结构与功能的影响。结果表明模型组与空白组和药物组比,短链脂肪酸(SCFA)含量差异显著(P<0.05),模型组总胆汁酸含量偏低,但差异不显著(P<0.05)。α多样性分析表明Ace、Chao1和Simpson的模型组与空白组比,显著降低(P<0.05),而Shannon中无差异(P<0.05)。PCoA结果表明雌性小鼠的APS组效果较差,其余组均处于模型组和空白组之间,说明效果较好,但离散程度分布规律较差;在雄性小鼠中,APS和LGG处于模型组和空白组之间,说明实验结果正常,而且复合组和白藜芦醇组相近,说明APS+LGG对肠道菌群的PCoA值较好,但离散程度无规律。可视化关联分析显示雌性小鼠的Helicobacter(OTU143)与WBC、CAT;Odoribacter(OTU500)与 WBC、RBC、PLT、HGB;Bacteroidales(OTU215)与 SOD;Bacteroidales(OTU6)与 GSH-Px;Alloprevotella(OTU244)与SOD均存在相关性,且差异显著(P<0.05)。在雄性小鼠中,Bacteroidales(OTU116)与 T-AOC;Bacteroidales(OTU162)与GSH-Px、T-AOC;OTU244 与 T-AOC;Bacteroidales(OTU3)与 HGB;Bacteroidales(OTU135)与T-AOC均存在相关性,且差异显著(P<0.05)。5.mRNA表达水平指出APS和LGG均能显著上调Sirt1基因、显著下调p21和p16基因的表达水平(P<0.01),且雌雄小鼠的调控结果存在显著差异(P<0.05)。以上结果阐明了 APS和LGG及其相互作用对延缓D-半乳糖致衰老小鼠的作用机制。
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