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目的:1.利用网络药理学预测当归芍药散治疗阿尔茨海默病的机制,为后续研究奠定工作基础。2.基于网络药理学的研究结果,通过细胞实验初步探讨当归芍药散治疗阿尔茨海默病可能的分子机制。3.建立复方当归芍药散水煎液体外指纹图谱,为其化学成分分析及质量控制标准的制定提供参考;方法:1.应用TCMSP数据库,对该复方药物进行筛选。对阿尔茨海默病和筛选出的化合物进行靶点预测。采用STRING在线数据库,对二者交集的靶点蛋白构建蛋白相互作用网络,并在cytoscape 3.6.1软件中进行可视化处理。在Unitprot数据库查询靶标蛋白的基因名,使用DAVID工具对查到的基因进行GO富集分析以及KEGG通路富集分析,考察中药的潜在靶标可能具有的生物学功能及通路,探究当归芍药散治疗AD的主要作用通路。2.本实验的PC12细胞模型为研究对象,以复方当归芍药散为出发点,结合前人的研究成果,试探究当归芍药散对高糖诱导PC12细胞损伤模型胰岛素信号通路的影响,探索AD发病机制是否与胰岛素抵抗相关,为中药复方分析及中药组方原理的研究提供参考。1)根据步骤1分析的结果,结合近年来的研究现状,本实验采用PC12细胞为研究对象,给予当归芍药散水煎液及GSK1838705A（IGF-1抑制剂）进行干预,MTT法检测细胞存活率,以检测药物对PC12细胞的作用以及对其生长不发生影响的浓度范围;2)选择不同葡萄糖浓度的培养基溶液,对PC12细胞进行培养,筛选出对其可造成显著损伤的浓度,以进行下一步试验;3)用步骤2)中选择的高糖浓度的培养基对PC12细胞进行培养,建立高糖损伤模型,把实验分为4组:空白对照组、模型对照组、GSK1838705A（IGF-1抑制剂）组、全方组。培养24h后,通过western blot技术,检测当归芍药散水煎液对PC12细胞APP蛋白以及胰岛素信号通路蛋白IGF-1、mTOR/p-mmTOR、P70S6K/p-P70S6K蛋白表达的影响。3.使用HPLC-DAD方法,采用梯度洗脱方法摸索复方当归芍药散水煎液的色谱条件,保证水煎液成分在体外能够尽量多的检测出来,并加以确定。然后选用具有代表性的标准品,对特征峰进行标定,用此法建立复方当归芍药散水煎液的HPLC-DAD指纹图谱。结果:1.从当归芍药散中筛选出38个化合物,涉及治疗阿尔茨海默病的9个靶点,网络分析结果表明靶点该方可能通过突触传递、乙酰胆碱受体信号通路、神经系统发育、信号转导等生物过程,并结合g蛋白偶联乙酰胆碱受体活性、过氧化物酶活性、乙酰胆碱结合胞外配体离子通道活性、β淀粉样蛋白结合作用等分子功能发挥作用;其作用机制主要与胆碱能突触通路、神经配体-受体相互作用通路、钙信号通路、尼古丁成瘾相关的信号通路、PI3K-Akt信号通路等有关。2.MTT实验结果显示:当培养基葡萄糖浓度大于等于100mmol/L时可以看到PC12细胞活力和空白组比较有显著差异;当归芍药散水煎液在生药浓度1-10 mg/ml内对PC12细胞生长并未有阻碍;胰岛素干粉溶液在0-20 μ g/ml的浓度范围内对PC12细胞生长有促进作用,选定5 u g/ml作为实验浓度;GSK1838705A在50-70 nmol/ml的浓度范围内,对PC12细胞活力没有影响,选定60 nmol/ml作为实验浓度。Western blot结果显示:当归芍药散可降低高糖损伤的PC12细胞的APP蛋白及IGF-1蛋白的表达,mTOR、p-mTOR、P70S6K以及p-P70S6K蛋白水平则显著提高。3.实验建立了复方当归芍药散水煎液的HPLC-DAD指纹图谱,确定了 22个共有峰,指纹图谱的相似度计算结果均大于0.91以上。结论:1.该部分研究体现了中药多成分-多靶点-多通路的特点,解析了当归芍药散治疗阿尔茨海默病的作用机制,为进一步开展当归芍药散治疗阿尔茨海默病的作用机制研究提供了思路和方法理论基础。2.当归芍药散通过胰岛素信号转导通路作用于高糖损伤的PC12细胞,可以对该细胞模型的APP蛋白、IGF-1蛋白表达起到抑制的作用,可能在分子水平上有逆转胰岛素抵抗的效果。m-TOR、p-mTOR、P70S6K以及p-P70S6K蛋白水平的提高,说明在该方作用过程中,存在激活胰岛素信号转导通路下游的mTOR/P70S6K通路的效果。3.本实验建立当归芍药散水煎液指纹图谱,建立一种全面的、低检出限的当归芍药散体外成分分析方法的,可以确保水煎液所含成分在体外被充分的检测出来,为后期的药理实验的用药的准确和可控提供参考。