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由结核分枝杆菌感染引起的结核病,是当今世界致死率最高的传染病之一。预防和控制结核病最关键的环节在于及早发现,准确用药,这就给结核病的早期诊断提出了迫切的要求。近年来,血清学诊断的方法越来越多的应用在了结核病的早期实验室诊断中,取得了不错的成绩,但是也存在着诸多问题。其中一个核心问题就是至今没有找到一个稳定且高效的特异性抗原,或抗原组合。所以,寻找敏感性及特异性都令人满意的抗原及抗原组合成为结核病血清学诊断的研究热点。本实验涉及到的的两种抗原为结核分枝杆菌与卡介苗(BCG)的基因差异区的两种假想蛋白,通过基因工程的方法直接表达出两种抗原,并且进行血清学诊断效果分析,第一可以简化操作,第二可以找到无法在结核分枝杆菌培养滤液中纯化得到的蛋白。本实验研究目的是通过构建结核菌TB15.3与TB16.3的重组多肽表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,并对表达产物进行纯化,以获得大量重组抗原,同时对重组多肽免疫反应性进行鉴定评价,为探索重组多肽在结核病血清学诊断的应用奠定前期实验基础。根据结核菌编码TB15.3与TB16.3肽段的基因系列,通过Primer Premier 5.0引物设计软件,分析设计特异引物,通过PCR技术从结核菌H37Rv基因组DNA扩增出目标抗原的基因片段,将目的片段克隆到原核表达载体pET-30a中,成功构建N端带有6个组氨酸标签的表达载体。利用化学转化法将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)菌株中,通过PCR筛选获得阳性的工程菌株；再经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,本试验成功获得了能够表达目的重组抗原的工程菌株。经梯度实验确定了工程菌发酵最适温度为28℃,诱导4h后,可达到最大表达量,诱导剂IPTG最适诱导浓度为1 mmol/L。表达方式分析发现该重组多肽在大肠杆菌中主要以可溶性蛋白的形式存在,并利用亲和层析方法对重组抗原进行了纯化。联合使用重组纯化的特异性蛋白抗原可以改善血清学诊断方法检测结核病人的敏感性和特异性。本研究还将重组的TB15.3与TB16.3蛋白组成联合抗原进行ELISA实验,结果显示TB15.3抗原检测结核病人血清抗结核抗体的敏感性为44.6%,检测健康查体者对照血清特异性为99%,TB16.3抗原检测结核病人血清抗结核抗体的敏感性为71.2%,检测健康查体者对照血清特异性为85.8%,两种抗原组成的联合抗原敏感度为65.3%,特异性为96.9%表明联合抗原可用于结核病的免疫学诊断试剂的开发。