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目的:1.初步了解HBsAg阳性母亲HBVDNACpG岛甲基化对母儿HBV复制与相关蛋白表达的影响及可能的免疫反应。2.进一步探讨HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛甲基化对婴儿乙肝疫苗免疫应答的影响,为提高婴儿乙肝疫苗免疫应答率提供依据。方法:1.研究对象及流行病学方法2011年6月至2013年7月连续收集山西省太原市第三人民医院妇产科的399对HBsAg阳性母亲及其新生儿。采集母亲分娩前24h内肘静脉血,新生儿出生24h内股静脉血。按照0,1,6月免疫接种方案对新生儿进行乙肝疫苗接种。于12±1月龄进行随访,并采集婴儿的股静脉血3ml。为满足克隆测序的要求,且在保证血清量足够完成本次实验的情况下,本次研究选择HBsAg阳性母亲HBV DNA载量≥106 IU/ml的母儿111对为研究对象。将婴儿发生乙肝疫苗无/弱应答者11例作为病例组,在完成随访的婴儿中完全随机选取婴儿乙肝疫苗强应答者40例作为对照组,共51例进行HBVDNA全基因组扩增,并进行基因分型。其中HBVC基因型有48例,故进一步对48例HBV C基因型的HBsAg阳性母亲样本进行甲基化处理及分析。2.实验室检测方法采用 real-time PCR-TaqMan 探针法检测 HBsAg 阳性母亲 PBMC HBV cccDNA含量;采用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）定量检测母儿HBVDNA;采用电化学发光法（ECLIA）检测母儿 HBV 血清学标志物（HBsAg、HBeAg、anti-HBs、anti-HBe、anti-HBc）。婴儿 anti-HBs<10mIU/ml 或 anti-HBs 在 10～100 mIU/ml 之间判定为无/弱应答,anti-HB s≥100 mIU/ml判定为强应答。采用ProcartaPlex多因子分析技术检测母儿血清中 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IFN-α 的含量。HBV DNA提取使用Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒,分单双链分别扩增后提纯,转化,克隆及测序,序列经过剪切及拼接为全长从而获得HBVDNA全基因组序列;使用BioEdit,EditSeq（DNA Star）,SeqMan软件进行基因序列整理,编辑及拼接;使用Mega6.0软件进行序列分析与基因分型;用引物在线设计“MethPrimer”预测HBVDNACpG岛的分布。采用亚硫酸氢盐测序法（BSP）进行HBVDNACpG岛甲基化的处理;使用在线软件“QUMA”了解CpG岛的甲基化情况。3.统计学分析方法使用SAS 9.4软件进行数据录入,整理与分析。服从正态分布的定量资料的描述用（x±s）表示,不服从正态分布定量资料的描述用中位数和四分位数间距[M（OR）]表示,组间比较分别采用t检验和Wilcoxon符号秩检验。定性资料的分析采用卡方检验或Fisher’s确切概率法。相关性分析采用Spearman秩相关分析。P<0.05为有统计学差异。采用GraphPad Prism 5软件作图。结果:1.HBsAg阳性母亲、新生儿和婴儿的一般情况HBV全基因组序列分析结果显示51例HBsAg阳性母亲中C基因型者有48例（94.12%）。本次研究选择C基因型母儿共48对做甲基化处理及分析。一般人口学特征比较结果尚未发现母亲及新生儿的一般情况在母亲HBVDNA发生甲基化与未发生甲基化组两组间差异有统计学意义（P>0.05）。尚未发现婴儿体重及身高在母亲HBVDNA发生甲基化与未发生甲基化两组间有统计学差异（P>0.05）。2.HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛甲基化对母儿HBV复制及相关蛋白表达的影响2.1 HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛分布特点通过CpG岛位置在线预测“MethPrimer”显示,本次研究的48例C基因型的HBsAg阳性母亲HBVDNA共检出5个CpG岛,包括常规岛CpG岛Ⅰ,CpG岛Ⅱ和CpG岛Ⅲ以及新型岛CpG岛Ⅳ与CpG岛Ⅴ。HBV DNA CpG岛的分布共4种类型,且该4种分布类型均含有CpG岛Ⅱ和岛Ⅲ。类型1（含CpG岛Ⅱ和CpG岛Ⅲ）占91.67%（44/48）,类型 2（含 CpG 岛 Ⅰ、CpG 岛 Ⅱ、CpG 岛 Ⅲ）占 4.17%（2/48）,类型 3（含 CpG 岛 Ⅱ、CpG 岛 Ⅲ、CpG 岛Ⅳ）占 2.08%（1/48）,类型 4（含 CpG 岛Ⅱ、CpG 岛 Ⅲ、CpG 岛Ⅴ）占 2.08%（1/48）。2.2 HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛甲基化情况甲基化分析结果显示:48例母亲HBV DNA CpG岛Ⅱ或岛Ⅲ发生甲基化有40例（83.33%）,其中CpG岛Ⅱ发生甲基化有39例（81.25%）,CpG岛Ⅲ发生甲基化有14例（29.17%）;岛Ⅱ与岛Ⅲ同时发生甲基化有13例（27.08%）,均未发生甲基化有8例（16.67%）。HBVDNACpG岛Ⅱ或岛Ⅲ克隆株甲基化发生率为45.42%（109/240）,CpG岛Ⅱ的克隆株甲基化发生率为33.33%（80/240）,CpG岛Ⅲ克隆株甲基化发生率为12.08%（29/240）。CpG岛Ⅱ或岛Ⅲ CG位点发生甲基化的甲基化率为 10.39%（1202/11564）,CpG 岛 ⅡCG 位点甲基化率为 11.14%（981/8806）,岛Ⅲ CG位点甲基化率为7.90%（218/2758）。HBV DNA CpG岛Ⅱ与岛Ⅲ甲基化分布不均匀,CpG岛Ⅱ甲基化发生率与CG位点甲基化程度均高于CpG岛Ⅲ。2.3 HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛甲基化对自身HBV DNA复制及蛋白表达的影响母亲HBV DNA CpG岛Ⅱ甲基化组PBMC HBV cccDNA载量显著低于CpG岛Ⅱ未甲基化组（Z=2.02,P=0.043）,anti-HBc水平高于CpG岛Ⅱ未甲基化组（Z=-2.07,P=0.039）。母亲 HBV DNA CpG 岛 Ⅲ 甲基化组 PBMC HBV cccDNA 量及 HBV DNA载量均低于未甲基化组,但差异均没有统计学意义（P>0.05）。分析HBsAg阳性母亲HBVDNA CpG岛Ⅱ与岛Ⅲ位于不同基因区的CG位点甲基化对母亲病毒复制及蛋白表达的影响,结果显示当母亲HBV DNA CpG岛Ⅱ位于P基因区的CG位点发生甲基化,其PBMC HBV cccDNA载量显著低于CG位点未发生甲基化,差异具有统计学意义（Z=2.02,P=0.043）。血清anti-HBc水平高于未发生甲基化的anti-HBc水平,差异具有统计学意义（Z=-2.07,P=0.039）。尚未发现母亲HBV DNA CpG岛Ⅱ位于X基因区的CG位点甲基化,HBV复制及表达的水平改变具有统计学差异（P>0.05）。母亲HBV DNA CpG岛Ⅲ位于P基因区的CG位点发生甲基化时,其PBMC HBV cccDNA水平显著低于该基因区未发生甲基化的PBMC HBV cccDNA水平（Z=-1.99,P=0.046）。母亲 HBVDNACpG 岛 Ⅲ 位于 C 基因区的CG位点发生甲基化时,anti-HBs表达量高于未发生甲基化组（Z=2.85,P=0.004）。2.4 HBsAg阳性母亲HBV复制及表达与Th1/Th2型细胞因子的关系采用spearman秩相关检验分析母亲血清HBVDNA,PBMC HBV cccDNA及血清学标志物与Th1型细胞因子（IL-2、IL-12、IFN-γ、IFN-α、TNF-α）和Th2型细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）之间的关系。结果显示:母亲PBMCHBV cccDNA水平与血清IL-6水平呈正相关,差异具有统计学意义（rs=0.858,P<0.001）。2.5 HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛甲基化对新生儿HBV复制及下游蛋白表达的影响分析母亲HBV DNA CpG岛甲基化与新生儿HBV DNA复制状态及血清生物学指标的关系,结果尚未发现母亲HBV DNA CpG岛Ⅱ与岛Ⅲ甲基化对新生儿体内HBVDNA的水平及相关生物学标志物的改变具有统计学差异（P>0.05）。进一步分析HBsAg阳性母亲HBVDNACpG岛Ⅱ位于P基因区及X基因区的CG位点甲基化与新生儿病毒复制及下游蛋白表达的关系,结果尚未发现新生儿HBV复制及下游蛋白表达的水平差异具有统计学意义（P>0.05）。尚未观察到母亲HBV DNA CpG岛Ⅲ位于P基因区及C基因区的CG位点发生甲基化对新生儿HBV复制及蛋白表达的影响具有统计学差异（P>0.05）。2.6母儿HBV复制及表达与新生儿Th1/Th2型细胞因子的关系采用spearman秩相关检验分析母亲及新生儿血清HBV DNA,PBMC HBV cccDNA及血清学标志物与新生儿Th1/Th2型细胞因子之间的关系。结果显示:母亲血清anti-HBc水平与血清IFN-γ水平呈正相关,差异具有统计学意义（rs=0.385,P=0.012）。新生儿血清anti-HBc水平与IFN-α水平呈正相关（rs=0.349,P=0.024）,差异具有统计学意义。3.HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛甲基化对婴儿乙肝疫苗免疫应答的影响3.1 HBsAg阳性母亲婴儿乙肝疫苗无/弱应答的影响因素分析按照婴儿乙肝疫苗免疫应答情况将婴儿分为无/弱应答组和强应答组,婴儿乙肝疫苗无/弱应答者9例,强应答者39例,无/弱应答率为18.75%。单因素分析发现新生儿血清HBeAg与anti-HBc水平在两组间分布差异均有统计学意义（P=0.001,P=0.038）。其余因素在无/弱应答组和强应答组两组间分布差异均无统计学意义（P>0.05）。3.2 HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛分布与婴儿乙肝疫苗无/弱应答的关系比较婴儿乙肝疫苗无/弱应答组及强应答组HBV DNA CpG岛的长度及CG位点的个数,结果显示:母亲HBVDNACpG岛的长度及CG位点的个数在婴儿乙肝疫苗无/弱应答组及强应答组间的差异均不具有统计学意义（P>0.05）。3.3 HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛甲基化与婴儿乙肝疫苗无/弱应答的关系分析HBVDNA CpG岛克隆株甲基化的发生率（HBVDNA发生甲基化的克隆株/总克隆株）及CG位点甲基化的程度（HBV DNA CpG岛发生甲基化的CG位点/总CG位点）与婴儿乙肝疫苗无/弱应答的关系,婴儿乙肝疫苗无/弱应答组仅CpG岛Ⅱ甲基化的发生率显著低于强应答组,差异有统计学意义（χ2=6.51,P=0.011）,仅CpG岛Ⅱ发生甲基化的CG位点甲基化率高于强应答组,差异具有显著性（χ2=5.48,P=0.019）。当CpG岛Ⅱ或岛Ⅲ CG位点发生甲基化时,CG位点甲基化率在婴儿乙肝疫苗无/弱应答组高于强应答组,差异有统计学意义（χ2=31.39,P<0.001）。分析HBVDNA不同基因区CpG岛甲基化与婴儿乙肝疫苗无/弱应答的关系,未发现HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛Ⅱ与岛Ⅲ位于不同基因区的克隆株甲基化的发生率在两组间的统计学差异（P>0.05）。无/弱应答组HBVDNA CpG岛Ⅲ中位于P基因区的CG位点甲基化率高于强应答组,差异具有统计学意义（χ2=5.56,P=0.018）。仅CpG岛Ⅱ发生甲基化时,CpG岛Ⅱ位于P基因区的CG位点在无/弱应答组的甲基化率显著高于强应答组,差异具有统计学意义（χ2=24.11,P<0.001）。3.4 HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛甲基化对婴儿HBV复制及表达的影响分析母亲HBV DNA CpG岛甲基化与婴儿HBV DNA复制状态及血清生物学指标的关系,结果尚未发现母亲HBVDNA CpG岛Ⅱ甲基化或岛Ⅲ甲基化对婴儿体内血清HBVDNA的水平及相关生物学标志物的改变有统计学差异（P>0.05）。进一步分析HBsAg阳性母亲HBVDNA CpG岛Ⅱ与岛Ⅲ位于不同基因区的CG位点甲基化与婴儿病毒复制及下游蛋白表达的关系,结果尚未发现母亲HBVDNA CpG岛Ⅱ位于P基因区及X基因区的婴儿HBV复制及下游蛋白表达的水平差异具有统计学意义（P>0.05）。尚未观察到母亲HBVDNA CpG岛Ⅲ位于P基因区及C基因区的CG位点发生甲基化对婴儿HBV复制及蛋白表达的影响（P>0.05）。3.5母儿HBV复制及表达与婴儿Th1/Th2型细胞因子的关系采用spearman秩相关检验分别分析母儿血清HBV DNA,PBMC HBV cccDNA及血清学标志物与婴儿Th1/Th2型细胞因子之间的关系。结果显示:母亲PBMCHBV cccDNA水平与婴儿血清IL-4水平呈负相关（rs=-0.431,P=0.012）,母亲血清anti-HBc水平与婴儿血清IL-10水平呈负相关（rs=-0.354,P=0.040）。新生儿血清HBeAg水平与婴儿血清IL-6水平呈正相关（rs=0.344,P=0.047）。婴儿血清HBeAg水平与血清TNF-α水平呈负相关（rs=-0.356,P=0.039）,婴儿血清anti-HBc水平与血清IL-6水平呈负相关（rs=-0.340,P=0.049）。3.6母儿Th1/Th2型细胞因子水平与婴儿乙肝疫苗无/弱应答关系比较婴儿乙肝疫苗无/弱应答组与强应答组两组间HBsAg阳性母亲及婴儿Th1/Th2型细胞因子水平。结果显示乙肝疫苗无/弱应答组HBsAg阳性母亲IL-6水平显著高于强应答组（Z=2.68,P=0.007）,IFN-α含量在无/弱应答组高于强应答组（Z=2.13,P=0.033）,差异均具有统计学意义。婴儿在乙肝疫苗无/弱应答组IL-10水平显著高于强应答组（Z=1.99,P=0.047）,差异具有统计学意义。未发现其余Th1/Th2型细胞因子在两组间的统计学差异（P>0.05）。结论:1.HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛甲基化可能影响HBV的复制及相关蛋白的表达HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛Ⅱ位于P基因区的CG位点甲基化可能抑制PBMC HBV cccDNA的转录,促进anti-HBc的表达。HBVDNACpG岛Ⅲ位于P基因区的CG位点发生甲基化可能抑制母亲HBV cccDNA的转录,CpG岛Ⅲ位于C基因区的CG位点发生甲基化可能促进anti-HBs的表达。但由于HBV DNA CpG岛Ⅲ在无/弱应答组未发生单独的甲基化,关于CpG岛Ⅲ甲基化的具体机制还需进一步的研究。2.HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛甲基化可能影响婴儿乙肝疫苗免疫应答HBV为C基因型的HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛分布不同,主要以CpG岛Ⅱ和岛Ⅲ为主,位置及长度略有差异。尚未观察到HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛分布与婴儿乙肝疫苗免疫应答间的关系,有待进一步研究。HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛Ⅱ甲基化发生率及甲基化程度均高于岛Ⅲ。HBV DNA CpG岛Ⅱ发生甲基化,且CpG岛Ⅱ位于P基因区的CG位点甲基化程度为低甲基化时,可能不利于婴儿乙肝疫苗无/弱应答的发生。发现接种乙肝疫苗后出现无/弱应答的婴儿相比强应答的婴儿,母亲HBV DNA CpG岛Ⅲ位于P基因区的CG位点甲基化程度更高。但可能由于样本量的限制,目前母亲HBVDNACpG岛Ⅲ甲基化对婴儿乙肝疫苗免疫应答的具体影响尚不十分明确。婴儿乙肝疫苗无/弱应答组的母亲PBMC HBV cccDNA水平高于强应答组,Th1/Th2型细胞因子平衡可能被打破,引起免疫反应的改变,作用于HBV及抗原的能力可能受影响,进而导致婴儿乙肝疫苗无/弱应答。关于Th1/Th2型细胞因子免疫反应的具体机制,有待进一步的体外实验研究。综上所述,HBsAg阳性母亲HBV DNA CpG岛甲基化可能抑制母亲HBV cccDNA的转录,抑制HBV DNA的复制,影响蛋白的表达如促进anti-HBc或anti-HBs的表达,可能影响Th1/Th2型细胞因子的合成及分泌,在一定程度上促进母儿免疫反应。若甲基化程度过高,上述过程可能发生改变,婴儿血清IL-10等免疫抑制因子分泌增加,从而可能使婴儿乙肝疫苗无/弱应答率升高。关于HBV DNA CpG岛甲基化与免疫应答关系的具体机制,还需扩大样本量或体外实验的进一步研究与验证。