论文部分内容阅读
目的:砷是一种常见的有毒环境类金属污染物,在自然界中分布广泛。长期无机砷暴露可引起恶性肿瘤、皮肤损伤和代谢相关疾病等多种健康效应。脂肪组织和骨组织等是无机砷作用的重要靶点,即使是在低剂量长期暴露也会引起这些组织的损伤,导致2型糖尿病和骨质疏松等疾病的发生。间充质干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能成体干细胞,可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。研究表明间充质干细胞是砷毒性作用的重要靶细胞。砷可以通过氧化应激等多种途径影响间充质干细胞的细胞活力,从而抑制脂肪和成骨细胞新生而影响脂肪和骨组织的健康。核因子E2相关因子(Nuclear Factor E2-related Factor,Nrf)1作为CNC-bZIP(CNC-basic Leucine Zipper)家族的重要转录因子,除了调节细胞氧化还原稳态外,还在细胞增殖与衰老、葡萄糖代谢、线粒体呼吸、胚胎发育与细胞分化等方面发挥重要调控作用。多项研究发现Nrf1在无机砷暴露诱导的细胞毒性作用中发挥重要作用。本研究拟用原代小鼠骨髓间充质干细胞(mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,mBM-MSCs)作为细胞模型,探讨长型Nrf1在急性无机砷暴露致间充质干细胞损伤中的作用并探索其潜在机制,为将来探索Nrf1在无机砷暴露致干细胞功能紊乱的机制研究提供新的思路。研究方法:本研究采用贴壁法分离原代小鼠骨髓间充质干细胞,国际细胞治疗协会推荐的鉴定方法进行鉴定。此分离技术在本研究组前期已完成条件摸索。不同浓度无机砷暴露后通过CCK-8实验检测细胞活力,免疫印迹实验检测NRF1不同分子量蛋白对砷的反应性。利用含有shRNA的慢病毒建立Scramble和LNrf1基因沉默(L-Nrf1-KD)稳定转染的细胞。无机砷暴露后通过观察细胞形态完整性、细胞活力、细胞凋亡率以及检测凋亡相关蛋白表达来判断Scramble和L-Nrf1-KD细胞的砷敏感性差异。5μM无机砷暴露24小时后,收集细胞;相同浓度无机砷暴露24小时后,替换为无砷完全培养液培养24小时后,收集细胞培养液,利用原子荧光法检测细胞对砷的蓄积和外排能力;通过mRNA-seq数据分析水通道蛋白(Aquaporin,AQP)和ATP结合盒式蛋白家族(ATP-binding Cassette Transporter C Family,ABCC)转运蛋白mRNA在mBM-MSCs中的表达丰度;检测基础状态和无机砷暴露对关键分子的mRNA和蛋白表达的影响。通过检测Nrf2的m RNA、蛋白以及下游基因表达水平;MitoSox Red探针检测线粒体源性活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平,来评估基础状态和无机砷暴露时Nrf2所介导的抗氧化防御作用。使用线粒体源性ROS特异清除剂Mito-quinone干预后观察细胞的形态完整性、细胞凋亡率以及细胞凋亡蛋白表达。结果:与对照细胞相比,无机砷暴露能显著诱导间充质干细胞细胞内长型NRF1蛋白表达水平(p<0.05)。与Scramble细胞相比,L-Nrf1-KD细胞形态与间充质干细胞表面标志物表达均未发生改变。砷(>10μM)暴露24小时后,LNrf1-KD细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3和cleaved-PARP表达显著高于Scramble细胞(p<0.05)。与Scramble细胞相比,L-Nrf1-KD细胞砷蓄积量无明显差异,但外排量降低15%(p<0.05)。通过对ABCC和AQP家族分子检测后发现,ABCC4可能是引起砷外排降低的主要原因。15μM无机砷暴露不同时点检测发现,L-Nrf1-KD细胞内NRF2蛋白水平在12小时后显著低于Scramble细胞(p<0.05),且NRF2下游抗氧化基因Gclc、Gclm、Nqo1以及Hmox1的m RNA水平亦显著低于Scramble细胞(p<0.05)。15-20μM无机砷暴露24小时,L-Nrf1-KD细胞线粒体源性ROS水平显著高于Scramble细胞(p<0.05);线粒体活性氧特异清除剂Mito-quinone处理后无机砷暴露所致L-Nrf1-KD细胞凋亡率显著降低(p<0.05)。结论:1.无机砷暴露诱导mBM-MSCs中NRF1的蛋白表达,且以L-NRF1为主。2.L-Nrf1缺失除可抑制ABCC4表达而抑制砷外排,还可增加mtROS水平,进而增强无机砷诱导mBM-MSCs毒性效应。