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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是一种昆虫病原菌,其特征是在形成芽胞的同时会产生由Cry蛋白组成的伴胞晶体,这些伴胞晶体对多种农业害虫具有毒杀活性。因此,Bt成为用于微生物农药最成功的微生物,此外,Bt的Cry蛋白基因也可以通过转基因作物的方式应用于农业上重要昆虫的防治。目前关于Bt Cry蛋白防治昆虫的研究相对较多,然而对于Cry蛋白防治线虫的研究还很有限。植物寄生线虫对农作物造成重大的损失,因此需要寻找对线虫具有较高毒性和较广谱的新型Cry蛋白。基于此,本研究集中于分离新菌株并使用基因组分析的方法来发掘新型Cry蛋白基因的工作。主要研究内容如下:1)通过100个Bt基因组分析发现在20%的Bt基因组中存在cry基因片段化的现象,通过对其中一个片段化基因cry5B-LN的功能研究发现该片段化基因与另一 Cry蛋白Cry5Ba的C端编码序列融合表达时,可以形成典型的伴胞晶体,同时该融合晶体蛋白可以造成线虫肠道上皮细胞连接的破坏,进而表现出对线虫具有毒杀活性,本研究结果揭示了片段化的cry基因可以作为潜在的具有活性的毒素资源。晶体蛋白典型的N端domain在毒素的活性及特异性上具有重要的角色功能,而C端domain帮助3D晶体结构的形成。然而在大规模Bt基因组测序中发现某些片段化的Cry蛋白基因多是N端或者C端的现象。在本研究的第一部分,我们筛选了 100个Bt基因组以调查这些片段化cry基因的发生。通过信息学分析发现除了 65个完整的cry基因之外,还有20个基因组中含有N端或C端的片段化基因。为了进一步研究片段化基因的表达和功能,本研究以一个片段化基因为例,该基因来自于具有杀线虫活性的Bt菌株C15的基因组,其编码序列覆盖了杀线虫晶体蛋白Cry5Ba N端的47%,且相似性为28%。因此将该片段化基因命名为cry5B-like N端基因（Cry5B-LN）。我们首先利用传统的Bt表达系统来表达cry5B-LN,发现该基因片段无法表达。然而,当将该片段与Cry5Ba的C端编码序列融合表达时,不仅可以表达晶体蛋白,还可以形成伴胞晶体,电子显微镜照片显示融合成的晶体为双棱锥形状。通过秀丽隐杆线虫（Caaenorhabditis elegans）的生测实验发现该N+C融合晶体蛋白对线虫具有明显活性,其半致死浓度LC50为23.7μg/ml,能够缩短线虫的寿命,同时影响线虫发育。通过镜检观察融合蛋白处理后线虫的病理学变化发现该融合蛋白能够造成线虫肠道的损伤,从而确定了该融合蛋白的作用部位。通过荧光显微镜观察融合蛋白处理后GFP标记的线虫突变体FT63的表型变化发现该融合蛋白可以造成线虫肠道上皮细胞连接的破坏,从而确定了该融合蛋白的作用方式。以上结果表明这些片段化的Cry蛋白基因可能是毒性较高的新型Cry蛋白的来源。本研究对片段化基因的进一步研究不仅有助于新型Cry蛋白基因资源的发掘,同时也有助于更好地研究Bt产生多结构域毒素的进化策略。2)通过Bt基因组分析发现了一个新型Cry蛋白Cry5Fa,该蛋白与υ报道对线虫具有活性的Cry5Ba具有一定相似性,但通过对该蛋白的活性检测发现Cry5Fa对具有Cry5Ba抗性的线虫突变体有毒杀活性,暗示了 Cry5Fa是一种广谱的具有杀线虫活性的新型晶体蛋白。本研究通过对Bt菌株F-14的基因组分析发现了一个潜在的新型Cry蛋白,其保守结构域与Cry5Ba具有一定的相似性,将其命名为Cry5Fa。序列分析表明,Cry5Fa的C端与Cry5Ba的C端的相似度更高,达到70%～80%,而Cry5Fa的N端与Cry5Ba的N端的相似度只有20%～30%,两个蛋白全长的相似度为58%。通过传统的Bt表达系统在Bt无晶体突变株BMB171中表达cry5Fa基因,发现该基因可以表达,并产生菱形晶体。通过对秀丽隐杆线虫及其糖脂突变体的生测实验发现Cry5Fa对秀丽隐杆线虫糖脂突变体（该突变体对Cry5Ba具有抗性）具有毒性,半致死浓度LC50为31μg/mL。该结果说明Cry5Fa作用于线虫的作用机制可能与Cry5Ba不一样。3)通过信息学分析发现Bt中存在Aerolysin类毒素Hydralysin,通过对该蛋白的活性检测发现单独的Hydralysin对线虫具有较低的活性,但与Cry5Ba复配时可以显著提高Cry5Ba的毒性,说明了 Bt中的Hydralysin可以作为毒力因子协同增强Cry蛋白的毒性。除了Cry蛋白之外,Bt还会产生大量的毒力因子参与杀虫的过程。这些毒力因子可以根据其序列和特异性进行分类。本研究发现了一个基因（750 bp）编码32.5 kDa的蛋白,通过序列分析发现它与β-穿孔毒素Aerolysin类毒素Hydralysin具有显著相似性。利用大肠杆菌异源表达表达并纯化了该蛋白,通过秀丽隐杆线虫的生测实验发现单独的Hydralysin蛋白对线虫具有较低毒性.,然而将其与Cry5Ba复配时能够显著增强Cry5Ba活性,该蛋白对Cry5Ba的杀线虫活性具有协同增效的效果。该结果说明了 Bt中的Hydralysin可以作为毒力因子协同增强Cry蛋白的活性。