骨骼会随着外界的环境与刺激的变化不断发生适应性改变,在机械应力的刺激下产生骨骼的代谢或者重建。在临床工作中需要合理利用骨骼的改建以达到事半功倍的效果,如正畸过程中对牙齿加力通过牙槽骨的吸收与重建使牙齿移动到适合的位置;牵张成骨中通过一定的牵张力刺激骨骼生长以及在骨折的愈合过程中,一定的力刺激可以更好地促进新骨形成,达到愈合。力学信号对于成骨细胞的功能激活起到重要的作用,成骨细胞将力学信号转化成为生物化学信号,再经过一系列级联反应最终促进骨骼的形态变化以及功能调整。应力在成骨细胞内的传递转化过程是十分复杂的,已证实细胞骨架是成骨细胞内的感知力的关键结构。这一细胞内纤维系统占细胞大部分的结构,由微管、中间丝和肌动蛋白丝等部分组成。细胞骨架网络被认为是维持张力恒定的基础,局部变形会影响整体骨架张力,进而启动细胞反应。ADF/Cofilin在调控肌动蛋白丝的动态重组中起到了重要的作用,ADF/Cofilin家族蛋白优先结合到ADP靠近肌动蛋白丝尖端的位置,并且通过对F-actin切割与解聚来增强F-actin分解。由LIM激酶LIMK1介导的对Cofilin磷酸化抑制了Cofilin解聚肌动蛋白的能力,Rho蛋白又位于这一通路上游对细胞骨架起一定的调节作用。进而推断在细胞受到外力刺激时,Rho蛋白以及Cofilin在细胞骨架介导的信号传导过程中发挥着独特的作用。本实验对人成骨肉瘤细胞MG-63进行12%力学加载,通过RT-PCR、Western-blot等方法,观察Rho蛋白和下游效应分子ROCK以及Cofilin表达之间的联系,从而对Rho/ROCK/Cofilin信号通路产生更多的认识,另外通过对Rho A蛋白进行抑制,观察Rho/ROCK通路对成骨效应影响,进而深入地了解成骨细胞信号传导的途径。目的:本实验使用Flexcell力学加载装置,对MG-63进行牵张应力加载,检测Rho、ROCK以及Cofilin蛋白表达的变化和在基因水平表达的差异。阻断Rho/ROCK通路后,对MG-63进行牵张应力加载,观察Cofilin表达情况及对成骨效应的影响。方法:1)对MG-63施加12%牵张应力,分别加载1小时、4小时、8小时、12小时、24小时,使用RT-PCR技术检测Cofilin基因表达,Western-blot技术检测蛋白的表达。2)对MG-63施加12%牵张应力,分别加载1小时、4小时、8小时、12小时、24小时,使用RT-PCR技术检测Rho、ROCK在基因水平表达的变化,Western-blot技术检测Rho、ROCK蛋白表达的变化。3)使用Rho/ROCK信号通路抑制剂预处理细胞后,对MG-63施加12%牵张应力,加载1小时、4小时、8小时、12小时、24小时后,用RT-PCR技术测定Rho/ROCK通路抑制后ROCK和Cofilin基因表达情况,Western-blot检测加力8小时ROCK和Cofilin的蛋白表达变化。4)使用Rho/ROCK信号通路抑制剂预处理细胞后,对MG-63施加12%牵张应力,加载1小时、4小时、8小时、12小时、24小时后,使用RT-PCR对下游成骨效应基因ALP、OCN和Runx-2的表达进行检测,并与不加抑制剂组结果进行对比分析。结果:对MG-63加载机械牵张应力后,Cofilin在8小时出现升高,随后降低。4小时Rho、ROCK开始出现基因表达增加,8小时达到最高,随后出现降低。细胞中加入抑制剂后,Rho/ROCK信号通路被阻断,再对MG-63加载机械牵张应力,Cofilin表达较正常加力减少,但仍高于空白对照组。阻断Rho、ROCK通路后,牵张应力对成骨效应基因表达的上调也受到抑制。结论:Rho及下游效应分子ROCK在应力作用下对Cofilin有一定调控作用,并且对成骨细胞的成骨作用产生影响。