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家蚕是一种重要的经济昆虫,蚕桑业是我国重要的经济产业,但是蚕病严重威胁着养蚕业的发展。家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染引发的家蚕血液型脓病是蚕业生产中危害最严重的家蚕病毒病,在生产中最常见,传染性强,易造成大面积爆发。因此,控制BmNPV的感染和传播、提高家蚕对BmNPV的抗性对桑蚕业发展具有重要意义。家蚕脂肪酶1(Bmlipase-1)是一种消化酶,在中肠组织中特异性表达。Bmlipase-1在BmNPV感染的起始阶段能抑制病毒,在蚕体第一道免疫防线中具有抵抗病毒的作用,但其抗病毒机制并不清楚。对Bmlipase-1基因的克隆和体外表达有助于进一步探究其抗病毒机制。本研究对Bmlipase-1基因进行克隆、密码子优化,并利用毕赤酵母真核表达系统体外表达家蚕脂肪酶Bmlipase-1,对表达结果进行分析和讨论。主要研究方法和结果如下:1.家蚕脂肪酶基因Bmlipase-1的克隆和生物信息学分析以5龄家蚕中肠组织为实验材料,利用TRIZOL法提取其总RNA,以随机六聚体引物进行反转录获得其第一链cDNA。设计引物,PCR扩增获得Bmlipase-1片段,转化到大肠杆菌DH5α中,成功克隆了Bmlipase-1完整CDS序列。生物信息学分析显示,其CDS序列全长885 bp,编码294个氨基酸,理论蛋白分子量31.74kDa,理论等电点9.33,不稳定指数23.13,脂肪族指数76.90,亲水性指数(GRAVY)-0.373,是稳定的亲水性蛋白,其二级结构以无规则卷曲为主。2.构建毕赤酵母重组菌株GS115/pPICZαA-Bmlipase-1将克隆的Bmlipase-1基因与穿梭质粒载体pPICZαA连接,电转化到毕赤酵母GS115中,使得Bmlipase-1基因整合到毕赤酵母基因组中。通过MM和MD平板筛选甲醇利用表型(Mut~+)转化子,菌液PCR及测序验证成功获得阳性重组毕赤酵母菌株。利用三丁酸甘油酯乳化平板检测转化子脂肪酶活性,结果显示,重组菌株菌落比对照菌株略大,但透明圈大小差异不明显,推测透明圈的产生是由于酵母自身脂肪酶的分泌,Bmlipase-1没有表达或表达量很低。3.Bmlipase-1基因密码子优化将克隆的Bmlipase-1基因进行密码子优化和全基因合成,以opt-Bmlipase-1命名。优化后的基因以高频密码子替换了低频密码子,其CAI值由0.68增加至0.97,达到了高基因表达水平;GC含量百分比由52.68%调整为39.35%;延长了mRNA的半衰期;除去了影响核糖体结合和mRNA稳定性的颈环结构。4.优化后Bmlipase-1基因的表达及表达分析将优化后的家蚕脂肪酶基因分别与穿梭质粒载体pPICZαA和pPIC9K连接,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-opt-Bmlipase-1和pPIC9K-opt-Bmlipase-1。将重组质粒电转化到毕赤酵母GS115中,通过多拷贝筛选、甲醇利用表型筛选、PCR验证及测序等方法获得阳性转化子。对重组毕赤酵母菌株进行甲醇诱导的摇瓶发酵实验,发酵至144 h。发酵液上清用TCA法浓缩20倍后进行SDS-PAGE。电泳结果显示阳性重组子发酵上清中杂蛋白明显多于空载对照菌株,其中一次的发酵上清在发酵至144 h时有疑似目的蛋白条带,但其他电泳结果中没有出现疑似目的蛋白条带。对照菌株发酵上清中蛋白较少,电泳条带较浅。进行Western Blotting检测和Ni-NTA亲和层析没有检测到目的蛋白的表达。影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素有很多,对此结果我们从目的基因自身特性和发酵条件等方面进行了分析和讨论。