丹皮、赤芍与白芍为临床上常用的中药,均为毛茛科芍药属植物。从古至今,各医学著作上对3者的传统功效记载有着明显的差异,且临床上也是用于治疗不同的病症,通常丹皮用于清肝火、凉血散瘀;赤芍用于散瘀止疼、凉血;白芍用于养血柔肝、平肝止疼。目前有学者研究发现丹皮、赤芍与白芍均含有酚酸类、萜苷类等小分子化合物及多糖类大分子化合物。牡丹皮、赤芍与白芍含有相似的化学成分,却产生不同的临床功效,而引起这种功效差异的物质基础目前尚未见报道。因此,本研究将从丹皮、赤芍、白芍基因差异、组分组成结构差异、药理活性差异等多层次揭示丹皮、赤芍、白芍药材“品种-ITS2序列-成分组成-药理活性”的关联性,为药材的临床应用与质量控制提供科学依据。中药是一个复杂且有序的整体,“组分结构”理论认为中药的整体体系是由三个层次构成的,第一层次:单体成分;第二层次:同一类别单体成分按照特定的配比结构构成组分;第三层次:各组分按照特定结构配比构成中药的整体。本课题运用中药指纹图谱、聚类分析、主成分分析等分析方法,并结合中药“组分结构”理论思想探究丹皮、赤芍与白芍内在成分组成结构特征,初步为丹皮、赤芍与白芍功效差异性提供物质基础研究。本课题研究内容包括以下几个方面。1.丹皮、赤芍与白芍药材“品种-ITS2序列-成分”的关联性从植物基因水平考察“品种-ITS2”的关联,通过检测丹皮、赤芍与白芍药材的DNA条形码中ITS2序列,可以发现丹皮药材与赤芍、白芍药材存在10个变异位点,不同产地丹皮药材的种内遗传距离明显小于丹皮与赤芍、白芍药材的种间距离,基于ITS2序列构建的NJ树显示不同产地的丹皮聚为一支,赤芍与白芍聚为一支。从药材化学成分角度考察“品种-成分”的关联,通过薄层色谱及高效液液色谱技术对丹皮、赤芍、白芍化学成分进行研究。薄层色谱分析显示,丹皮、赤芍与白芍药材中所含的斑点类别相似,但斑点的颜色及大小都存在差异;采用高效液相色谱技术构建丹皮、赤芍与白芍药材的指纹图谱,通过聚类分析及主成分分析可以看出丹皮、赤芍、白芍各聚一类,且各药材的代表性成分均存在差异。2.丹皮、赤芍与白芍的功效差异性评估(1)补血功效研究:建立小鼠血虚症模型,通过检测外周血中WBC(白细胞计数)、rbc(红细胞计数)、hb(血红蛋白)、hct(红细胞压积)、mchc(平均红细胞血红蛋白浓度)及观察胸腺及脾脏的病理改变,发现赤芍组能够显著升高wbc、hct;白芍组显著升高wbc、rbc、hct、hb,赤芍与白芍均能明显减少mchc;则丹皮组对外周血中的各指标无明显的改善作用,赤芍组与白芍组对血虚症小鼠的胸腺及脾脏均有不同程度的改善,丹皮组则对脾脏有所改善。(2)清热凉血、止血功效研究:建立血热出血模型大鼠,通过检测血浆pt(凝血酶原时间)、aptt(活化的部分凝血活酶时间)、tt(凝血酶时间)、fib(血浆纤维蛋白原),全血粘度及血浆粘度和观察肝脏及肺部的病理改变,发现丹皮组及白芍组能够显著延长aptt、tt,降低fib;赤芍显著降低pt,延长aptt,且能够显著改善血液粘度及血浆粘度;丹皮组及赤芍组对肝脏及肺损伤均有一定的改善作用。(3)活血化瘀功效研究:建立急性血瘀及颈总动脉血栓模型,通过检测凝血四项、血液流变学、血小板黏附率、纤溶系统、炎症蛋白表达等指标,发现赤芍组对凝血四项及血液流变学的影响较丹皮与白芍强,丹皮对血小板黏附率的抑制作用较大,丹皮与白芍下调cox2(环氧化酶2)、tlr4(toll样受体4)、il-1β(白细胞介素1β)、il-6(白细胞介素6)的表达,赤芍组降低cox2、tlr4、il-1β的表达,且丹皮对炎症蛋白的表达的影响明显强于赤芍与白芍。通过不同的动物模型对丹皮、赤芍与白芍的功效进行评价,发现白芍与赤芍的补血功效强于丹皮,而丹皮与赤芍的活血化瘀功效强于白芍,且赤芍对凝血四项及血液流变学的影响较丹皮强,而丹皮对炎症蛋白表达影响较赤芍强。3.丹皮、赤芍与白芍药材功效物质基础组成结构特征研究基于“组分结构”理论思想,对各药材中的总苷组分及酚酸组分的成分组成结构进行解析,发现丹皮、赤芍与白芍药材中各组分的化学成分组成结构存在显著性差别,初步为各药材功效差异提供物质基础研究。采用h2o2诱导huvecs损伤模型,以ldh(乳酸脱氢酶)、sod(超氧化物气化酶)、mda(丙二醛)的含量和mcp-1(单核细胞趋化蛋白)、icam-1(细胞间黏附分子)的表达水平为指标,评价丹皮、赤芍、白芍药材中总苷组分、酚酸组分及多糖组分活性,研究结果表明丹皮、赤芍、白芍药材中总苷组分、多糖组分对氧化损伤的HUVECs具有较好的保护作用;赤芍及白芍酚酸组分无明显的保护作用,而丹皮酚酸组分具有抗氧化应激作用,减轻血管内皮细胞损伤。综上,本文通过DNA条形码ITS2序列、薄层及高效液相色谱对丹皮、赤芍与白芍药材的“品种-ITS2-成分”的关联性研究,并采用多种动物模型对3药材的功效进行差异性比较,结合“组分结构”理论探究丹皮、赤芍与白芍功效差异的物质基础。