肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)是临床肝脏外科手术如肝脏移植、肝部分切除等过程中经常遇到的病理生理现象,也是导致肝脏移植失败,肝脏功能衰竭,病人愈后较差的重要原因。研究证实:缺血再灌注时可以产生大量的活性氧族(reactive oxygen species:ROS)对肝脏组织细胞的过氧化损害是导致HIRI的主要机制之一。ROS的成员主要包括超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)以及羟自由基(OH)等。它们的化学性质非常活泼,一些重要的胞膜和胞内的蛋白(包括结构蛋白和功能蛋白)可与其发生过氧化反应,改变细胞膜的结构,影响细胞功能,甚至引起细胞和组织死亡。肝脏是机体重要的物质代谢场所。其功能受损必然引起邻近或远端脏器的代谢和功能异常。心脏是机体内耗氧量大、对缺血缺氧反应非常敏感的脏器之一。当阻断肝脏血液供应再恢复其灌注的过程中,肝脏处于高度氧化应激状态,此时心脏是否也会遭受过氧化损伤?有待研究。Prx III是近几年发现的一类过氧化物酶系Peroxiredoxin(Prx)的家族成员之一。研究表明:Prx III是在细胞的内质网中合成产生,而后经定位信号定位于线粒体。Prx III是整个Prx家族中唯一特异性的定位于线粒体内的酶蛋白。细胞内的ROS主要来源于线粒体内呼吸链的电子泄露。近些年的研究显示:细胞线粒体内H2O2的清除与Prx III有密切关联。心脏是人体重要器官,其耗氧量非常强大,心肌细胞的能量供给主要是通过线粒体的氧化磷酸化。在此过程中会有大量ROS生成。因此,心脏是机体内最容易受到ROS过氧化损伤的器官。在HIRI发生后,心肌组织Prx III的表达如何变化,是否参与氧化应激反应?未见报道本研究通过无损伤血管夹将通往大鼠肝中叶与肝右叶的血管和胆管蒂夹闭,30 min后移开血管夹,制造大鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型,然后观察大鼠血清LDH水平、心肌组织内MDA水平,Prx III的m RNA和蛋白表达水平。探讨肝脏缺血再灌注损伤后心肌组织内的氧化应激状态以及Prx III的抗氧化作用。目的:观察大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型心肌组织内的氧化应激水平以及Prx III m RNA和蛋白表达水平的改变,探讨其在心内氧化应激反应中发挥的作用。方法:1大鼠肝缺血再灌注损伤模型的制备及取材选用12只雄性健康Wistar大鼠,体重190-210g,于河北医科大学实验动物中心购得。随机分为肝缺血再灌注损伤组(HIRI)6只,对照组(Con)6只。6%水合氯醛(自配)按0.5ml/kg计量,对大鼠进行腹腔注射,将其麻醉。参照Kohli等人的方法,用玻璃针轻柔分离肝血管和胆管,游离出通往肝中叶和肝右叶的血管和胆管蒂,用无损伤血管夹将其夹闭。30分钟后移开血管夹,恢复肝中叶和肝右叶的血液供应,制造肝实质70%的肝缺血再灌注损伤模型。对照组大鼠麻醉后,只游离肝中叶和肝右叶的血管和胆管蒂,30分钟后关腹。肝脏恢复血供6小时后再次将其麻醉,收集大鼠血液,用于ALT(丙氨酸氨基转移酶)和LDH(血清乳酸脱氢酶)的活性测定;取大鼠肝脏,将其置于4%多聚甲醛溶液中进行固定,用HE染色法观察大鼠肝组织的形态学改变;取大鼠心脏,用冰生理盐水洗去心脏表面和心腔内的余血,将心脏置于液氮中用于Prx III m RNA水平、蛋白水平测定以及MDA含量测定。2测定指标及方法2.1 HE染色法观察大鼠肝脏的形态结构肝组织经常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明,石蜡包埋后,进行切片,厚度约5μm,用苏木精伊红染色,在日产Olympus光学显微镜下观察大鼠肝脏组织的形态结构变化。2.2大鼠血清中ALT活性的测定大鼠血液未经抗凝处理,3000rpm离心10min后分离血清,用血清ALT全自动生化分析仪测定其含量。2.3大鼠血清中LDH活性的测定大鼠血液LDH活性的测定,按照试剂盒的操作说明,采用LD-L速率法测定。从-80℃冰箱中取出肝缺血再灌注损伤组及对照组大鼠的心肌组织,按照10mg/100μl的比例,加入4度匀浆缓冲液(PH7.4,磷酸钾缓冲液50mmol/L,PMSF1mmol/L,盐酸苯甲脒1mmol/L,Na Cl0.5mol/L,0.1%Tween-20,β-巯基乙醇5mmol/L,EDTANa31mmol/L),冰浴中匀浆,4℃匀浆液4000rpm离心20分钟,取上清即制成10%心组织匀浆,心组织匀浆内MDA含量经南京建成丙二醛(MDA)测定试剂盒测定。2.5大鼠心肌Prx III m RNA水平测定用TRIzol法提取大鼠心肌RNA。将3μg RNA反转录生成c DNA。用GAPDH作为内参照,进行RT-PCR。用Prx III扩增产物的灰度值与GAPDH扩增产物的灰度值相比,表示目的基因Prx III的相对表达量。2.6大鼠心肌Prx III蛋白水平测定采用Western blotting的方法测定大鼠心肌内Prx III蛋白的相对表达量。将-80度冷冻的大鼠心肌组织制成匀浆液,离心后取上清。用改良的Lowry法进行蛋白质总量测定。两组大鼠各心肌样本蛋白上样量为68ug。经转膜、封闭处理后,在PVDF膜上加入一抗,室温静置过夜。洗膜后,再加入辣根过氧化物酶标记的二抗。按照发光剂操作说明进行显影、定影、晾干。对胶片进行扫描,并做图像分析,以条带的灰度值表示其蛋白含量,将Prx III的灰度值与内参照GAPDH的灰度值相比,所得即Prx III蛋白的相对表达量。结果:1大鼠肝脏形态学改变在光学显微镜下可见肝缺血再灌注损伤组大鼠的肝组织淤血严重,肝细胞受压萎缩,肝血窦扩张充血明显,肝细胞胞浆内有空泡出现并且染色变浅,有部分肝细胞水肿,染色变浅,体积增大。对照组大鼠肝细胞排列整齐成条索状,围绕中央静脉排列成放射状,肝血窦无扩张充血大小均匀。2血清ALT水平Con组大鼠血清中ALT为20.03±5.23U/L,而HIRI组血清ALT为87.43±9.06 U/L。HIRI组大鼠血清ALT水平明显高于Con组(P<0.01)。3血清LDH水平Con组大鼠血清中LDH为481.50±67.15U/L,而HIRI组血清LDH为658.83±94.15 U/L。HIRI组大鼠血清LDH水平明显高于Con组(P<0.01)2.4大鼠心肌匀浆的制备以及MDA含量的测定4心匀浆内MDA的含量Con组大鼠心肌组织MDA的含量为9.24±1.72mmol/g,而HIRI组MDA含量为12.73±1.84 mmol/g。HIRI组大鼠心肌组织MDA的含量明显高于Con组(P<0.01)5大鼠心肌组织Prx III m RNA相对表达量大鼠心肌组织中抗氧化物酶--Prx III m RNA的表达量采用RT-PCR的方法测定。计算与内参照的比值得出相对表达量进行结果统计。分析表明:HIRI组大鼠心肌组织的Prx III m RNA水平均明显高于Con组(P<0.01)。说明HIRI组大鼠心肌组织内Prx III表达升高。6大鼠心肌组织中Prx III蛋白相对表达量采用Western blotting的方法测定大鼠心肌内Prx III蛋白的相对表达量。计算与内参照的比值得出相对表达量进行结果统计。分析表明:HIRI组大鼠心肌中Prx III蛋白的相对表达量(0.84±0.18)明显高于对照组(0.58±0.13)(P<0.05)。结论:1结扎肝右、中血管和胆管蒂可成功建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型。2大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型血清LDH和心肌组织MDA含量增加,提示:心肌组织已遭受过氧化损伤;Prx III的基因水平、蛋白水平均明显增强,说明:Prx III参与了缺血再灌注所诱发的氧化应激反应。