论文部分内容阅读
病毒性传染病一直是全球公共卫生领域关注的焦点。且大部分的病毒性传染病尚无有效的疫苗和治疗药物。因此建立准确、快速、可靠的诊断方法已成为预防和控制传染性疾病的重要措施。埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD)也被称作埃博拉出血热(Ebola hemorrhagic fever,EHF),该疾病是由埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)引起的急性出血性传染病,2014年西非暴发埃博拉疫情,此次疫情是自1976年埃博拉病毒被发现以来,规模最大、波及范围最广的,受到全球关注。当前,核酸检测方法已成为一种非常重要的检测手段,核酸检测依据是否具有温度循环依赖性可分为变温扩增和恒温扩增。变温扩增以聚合酶链式反应(PCR)为代表,但该类方法耗时较长,且需要精密仪器。相比而言,等温核酸扩增方法如环介导等温扩增方法(Loop mediated isothermal amplification,LAMP)、等温多自配引发扩增方法(Isothermal multiple-self-matching-initiated amplification, MSA)是在恒定温度下进行反应,其具有快速、灵敏、高效、特异性高的特点,对设备要求低,非常适合现场和基层工作需要。首先本文分别建立了针对扎伊尔型埃博拉病毒(Zaire Ebola virus, ZEBOV)核蛋白基因(nuclear protein,NP)以及糖蛋白基因(Glycoprotein, GP)的等温多自配引发扩增方法-RT-IMSA (NP,GP),并且针对NP基因建立了实时荧光定量PCR方法--RT-qPCR(NP)。根据Gen Bank中公布的埃博拉病毒的NP基因、GP基因序列,经过序列比对选择保守区设计引物并且在恒定温度63℃的条件下进行扩增。通过颜色判定法和实时荧光法进行结果判定。对登革病毒和脑炎病毒及健康人血浆进行了特异性验证,无交叉反应；且对梯度稀释的体外转录RNA、以及含有ZEBOV NP基因、GP基因扩增区域的病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)进行灵敏度分析,并且与李阿茜等人建立的检测埃博拉病毒GP基因的实时荧光定量PCR方法--RT-qPCR(GP)进行平行比较。结果显示,无论是体外转录RNA还是病毒样颗粒,RT-IMSA(NP)与自己建立的RT-qPCR(NP)灵敏度相当,为103拷贝／反应,RT-IMSA(GP)与RT-qPCR(GP)灵敏度相当,为102拷贝／反应。同时在塞拉利昂完成了RT-IMSA(NP)的埃博拉疑似病例血液样本的检测,并与中国疾病预防控制中心获批的检测埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒比较。临床样本结果显示：与已获批的荧光定量PCR试剂盒比较,RT-MSA(NP)的灵敏度和特异性分别91.4%和100%。因此,上述等温多自配引发扩增方法有望应用于埃博拉病毒感染的快速筛选,具有在偏远地区应用的潜力。其次,本研究探讨了DNA在同向平行互补的情况下是否可以实现延伸与扩增这一问题。通过重复相关文献中的实验和设计补充实验,结果证明DNA在同向平行互补的情况下,无论是进行聚合酶螺旋式反应(polymerase Spiral Reaction, PSR),或是进行平行互补聚合酶链式反应(parallel direction polymerase chain reaction, PD-PCR)均不能实现扩增。综上所述,本研究成功建立了针对扎伊尔型埃博拉病毒NP基因和GP基因的等温多自配引发扩增方法—RT-MSA(NP)和RT-MSA(GP),为埃博拉病毒感染快速诊断提供了技术支持,为应对国内可能发生的疫情提供了技术储备。此外,对DNA在同向平行互补情况下是否可以实现延伸与扩增这一问题进行了初步探讨。