树鼩IL-2和IL-6基因克隆、分子特征分析及实时荧光定量PCR方法的建立

来源 :北京协和医学院中国医学科学院 北京协和医学院 中国医学科学院 清华大学医学部 | 被引量 : 0次 | 上传用户:redbird_zdc
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树鼩(Tupaia belangeri,tree shrew)是一种生活在热带和亚热带地区的哺乳纲攀鼩类的小型动物,形态酷似松鼠,与人类有较近的亲缘关系。由于其具有体型小、易驯化、繁殖周期短、饲养管理成本低等优点,自上世纪80年代开始,就被相继用于多种人类疾病模型的建立,如丙型肝炎动物模型、乙型肝炎模型、手足口病模型及糖尿病模型等,但是,目前尚缺乏评价这些模型的细胞免疫方面的检测指标,究其原因是对树鼩免疫细胞因子方面的研究及检测方法鲜有报道,这严重阻碍了树鼩作为一种理想的人类疾病动物模型的进一步应用。  白介素是一类重要的细胞因子,在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用,是20世纪80年代后才发现的一类细胞因子,参与机体的免疫应答和某些疾病的病理过程。CD4+辅助性T细胞分为两种不同的效应群,Th1主要增强细胞介导作用,白介素-2(IL-2)是Th1的重要细胞因子,Th2主要增强体液免疫作用,代表因子是白介素-6(IL-6)。IL-2主要由T淋巴细胞分泌,能激活多种免疫细胞,诱导T淋巴细胞、自然杀伤细胞等的增殖、分化和抗体分泌,同时可诱生分泌多种细胞因子等免疫活性物质,增强机体免疫功能,在抗肿瘤、抗毒素、免疫调节及感染性疾病的治疗等中具有重要作用。IL-6又称B细胞刺激因子,几乎能影响免疫系统的所有细胞,主要诱导活化后期的B细胞大量合成分泌型Ig的mRNA从而增加Ig(IgM、IgG和IgA)的分泌。在急性炎症反应中IL-2和IL-6对多种细胞有促炎作用并诱导肝组织产生急性反应蛋白,在一定程度上反映机体病理过程。所以,IL-2和IL-6的检测为某些疾病的早期诊断和判断疾病发展、预后提供了可靠的依据。  本实验以获得树鼩IL-2和IL-6全长编码序列为目的,以树鼩外周血总RNA为材料,通过RT-PCR扩增,首次得到了长度分别为465bp、654bp的树鼩IL-2和IL-6全长编码序列,通过Clustal W等软件对其序列和分子特征进行分析,发现树鼩IL-2、IL-6氨基酸序列都存在自身的一些保守性序列且都表现出与人、猴较近的亲缘关系。同时,通过Discovery Studio对人和树嗣的IL-2、IL-6进行了蛋白三维空间建模,结果显示树鼩IL-2、IL-6有着与人相应分子相似的蛋白结构,但在部分表面电荷分布、糖基化位点和二硫键数目上存在差异。随后,我们以确定的树鼩IL-2、IL-6全长编码基因序列为模板,设计特异性引物和探针,并制备标准品和标准曲线,在分子水平建立实时荧光定量PCR检测树鼩血清中IL-2、IL-6的方法,为今后树鼩IL-2、IL-6单克隆抗体的制备及功能研究提供了必要条件,同时,也为今后研究IL-2、IL-6在树鼩疾病模型中的免疫调节机理奠定基础。
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