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胸腺素β4(Thymosin beta4, Tβ4)是肌动蛋白结合肽家族的一员,具有促进毛囊发育,加快毛发生长的作用。为了深入了解Tβ4基因对毛囊发育与毛发生长的作用,本研究构建了表皮特异性表达载体,并通过转染阿尔巴斯绒山羊耳尖皮肤成纤维细胞,验证启动子的表达能力。通过原核注射技术,制作转Tβ4基因小鼠,得到PCR阳性小鼠,并检测阳性小鼠尾尖Tβ4基因mRNA水平的表达量。1.表皮特异性表达载体pODsRed-KTP和pCDsRed-KTP的构建本研究构建了2个表皮特异性表达载体：pODsRed-KTP和pCDsRed-KTP。 pODsRed-KTP以角蛋白14启动子(keratin14promoter,pKRT14)指导Tβ4基因的表达,并以Oct-4启动子(Oct-4promoter,pOct-4)指导红色荧光蛋白的表达。作为对照载体,pCDsRed-KTP以pKRT14指导Tβ4基因的表达,以CMV启动子(CMV promoter, pCMV)指导红色荧光蛋白的表达。pKRT14是表皮特异性启动子,指导Tβ4基因在表皮类细胞中过表达,使得pODsRed-KTP与pCDsRed-KTP具有表皮特异性。pODsRed-KTP与pCDsRed-KTP区别在于pODsRed-KTP的红色荧光蛋白只在部分干细胞中表达,可以对干细胞进行示踪,而pCDsRed-KTP的红色荧光蛋白在大量细胞系中均表达,主要在后续试验中为pODsRed-KTP做对照。2.转染阿尔巴斯绒山羊耳尖皮肤成纤维细胞验证pKRT14功能将表皮特异性表达载体pODsRed-KTP和pCDsRed-KTP转入阿尔巴斯绒山羊耳尖皮肤成纤维细胞。以表达红色荧光蛋白的转pCDsRed-KTP细胞为对照,推测pODsRed-KTP的瞬时转染效率,约为31%。筛选稳定过表达Tβ4基因的细胞,检测Tβ4基因在mRNA水平的表达情况,与未转基因细胞相比,表达量上调了4.51倍。结果表明,pKRT14是有效的,能够启动Tβ4基因的表达。3.转Tβ4基因小鼠的制备与鉴定通过原核注射技术得到50只待检测幼鼠,经过PCR鉴定得到4只阳性小鼠,包括1只公鼠和3只母鼠,阳性小鼠得率为8%。检测Tβ4基因在阳性小鼠尾尖mRNA水平的表达量,与正常小鼠比较,阳性小鼠的mRNA水平的表达量介于1.32-2.05倍之间。本研究制作并初步鉴定了转Tβ4基因小鼠,为进一步研究Tβ4基因的功能,探索其作用机制等相关研究奠定了基础。