人参(Panax ginseng C.A.Mey)为五加科多年生草本植物人参的干燥根。人参在我国的药用历史已有约四千年，早在《神农本草经》里，它就被列为上品。现代药学研究证明，人参对中枢神经系统，免疫系统等都有显著作用。人参皂甙是人参中的主要活性成分。人参中分离并鉴定的皂甙大约有40种。近年来的研究发现稀有人参皂甙Rd有很多重要的药理活性，但由于在人参中的含量较低，直接从人参中分离这种稀有皂甙是非常困难的。而人参皂甙Rb1在人参中含量最高，在结构上和Rd只在C-20位上相差—个葡萄糖残基，因此，通过对人参皂甙Rb1的结构修饰来获得稀有人参皂甙Rd具有非常重要的生理学意义。用酶转化人参皂甙具有条件温和，步骤简单，定向转化，产物易分离，副产物少等众多的优点，是制备稀有人参皂甙的首选。 本实验室经过试验研究从多种真菌中筛选出了一种真菌—褐孢霉，此菌能产生一种胞外β-糖苷酶，专一性水解Rb1为Rd。本文主要对褐孢霉产生的人参皂甙Rb1水解酶进行了分离纯化及其性质研究。 本文的主要研究结果如下： 1.人参皂甙Rb1水解酶分离纯化方法的探索 首先尝试用多种方法对人参皂甙Rb1水解酶进行分离纯化，以pNPG为底物检测酶活。将培养7天的褐孢霉培养液依次通过超滤浓缩，(NH4)2SO4盐析，DEAE-SepharoseCL-6B离子交换层析，Sepharose CL-6B层析，Q-Sepharose fast flow，Mono Q HR 5/5阴离子交换层析(HPLC)，最终得到一种在电泳上基本呈单一条带的β-糖苷酶。通过上述方法的探索，结果发现培养7天褐孢霉所产生的Rb1水解酶酶活较低，粗酶液在超滤浓缩过程中酶活有一定量的损失，在以后的实验中应加以改进。 2.人参皂甙Rb1水解酶的分离纯化 经过了之前的条件探索，在大规模制备此酶的过程中进行了一些改良措施。经过测定确定褐孢霉产生的Rb1水解酶的酶活力最高时应该是培养84h时，故取培养84h时的褐孢霉培养液依次经过DEAE-纤维素离子交换层析，DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析、(NH4)2SO4盐析、Sepharose CL-6B凝胶层析、Phenyl sepharose CL-4B疏水层析、Mono Q HR5/5阴离子交换层析(HPLC)和Bio-Scale CHT20-1(HA)羟基磷灰石层析，最后得到在SDS-PAGE电泳上呈单一条带且在凝胶过滤层析中呈单一对称峰的β-糖苷酶，并应用SDS-PAGE电泳和凝胶过滤层析对其纯度和分子量进行了测定，纯度可达98％以上，利用SDS-PAGE电泳测得此酶的分子量为105KD，用凝胶过滤层析测定其分子量为210KD，说明此酶是由两个亚基组成的二聚体蛋白。经过纯化得到的纯酶与之前的粗酶液相比，纯化倍数达到540倍，酶活回收率为7％，纯化后的比活力可达到23768U/mg。 3.人参皂甙Rb1糖苷酶的酶学性质的研究： 对纯化后的β-糖苷酶进行的酶学性质研究表明：酶的最适温度为45℃，温度低于40℃时酶的稳定性较好。最适pH为5.5，在pH 5-6.5范围内酶的稳定性较好。Ca2+，Mg2+，Ba2+在0.25M时分别对酶活性显现一定的抑制作用，酶的相对酶活力分别下降到80％，79％和78％，Na+，K+，Mn2+在0-0.25M的浓度范围内对酶活性几乎没有影响，EDTA，Cu2+，Zn2+在0.25M对酶活性有较强的抑制作用，而SDS在0.25M对酶活性有强烈的抑制作用。在加入巯基保护剂后，SDS对酶活的影响降低，提示酶分子中的二硫键应该处在酶发挥活性的关键部位。酶的底物专一性测定表明此酶对β-葡萄糖苷键具有特异性。酶对底物的水解能力依次是纤维二糖、乳糖、蔗糖、pNPG和人参皂甙Rb1。动力学参数的研究表明酶的Km值为0.18 mM，最大反应初速度为5.52 mM/min。氨基酸序列分析结果证明此酶为一种新的蛋白，并与属于糖苷水解酶家族3的真菌β-糖苷酶有显著的同源性。 综上所述，本论文从褐孢霉培养液中分离纯化出了一种能够高效水解人参皂甙Rb1的β-糖苷酶，并对其酶学性质进行了鉴定。用此酶转化人参皂甙Rb1制备稀有人参皂甙Rd，专一性强、得率高、无副产物生成，为工业化应用奠定了基础。