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研究背景与目的：肺癌(Lung cancer)是我国最常见的恶性肿瘤,2015年国家癌症中心发布的数据显示,肺癌是发病率最高的肿瘤,也是癌症死因之首。其中以非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer. NSCLC)最为多见,约占肺癌总数的80%-87%。随着对NSCLC研究的深入,表皮生长因子(Epidermal Growth Factor Receptor. EGFR,又称ErbB1或HER1)在NSCLC的发病机制、启动基因、肿瘤细胞生长、细胞异质性和侵袭力增加过程中的作用被逐渐阐明,使EGFR成为靶向治疗的重要靶点之一。尽管靶向药物能够使肿瘤缓解率增加、无症状生存期延长,但随着TKIS使用时间的延长,不可避免的出现耐药。因此,研发延缓或者逆转靶向治疗耐药的方法是靶向治疗的热门领域。黄芪是常用的中药材,含有许多化学成分,大量基础及临床研究报道,黄芪在体内和体外均有抗肿瘤作用,黄芪甲甙(Astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)是黄芪的主要成分之一,研究表明,AS-IV可以通过调节性T细胞和细胞毒性T淋巴细胞以及通过相关的信号传导途径抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。SIRT6是NAD+依赖性第Ⅲ类组蛋白去乙酞化酶家族(Sirtuin家族)中重要的一份子。表观遗传调控是目前肿瘤研究的热点,通过DNA、组蛋白等甲基化、乙酞化、磷酸化以及染色体重塑等一系列生物过程来调节基因表达。现在研究发现,SIRT6在肿瘤组织中的表达情况与肿瘤发生、肿瘤转移、术后生存率、术后复发率以及化疗敏感性密切相关,目前认为SIRT6是一个新的肿瘤相关基因、减轻或者抑制,甚至逆转化疗耐药的新靶点。研究目的是(1)探究SIRT6在NSCLC组织中的表达丰度及表达定位,以及SIRT6在人肺癌NCI-H1299、PC9/GR、A549细胞中的表达；(2)不同浓度黄芪甲甙作用于人肺癌NCI-H1299、PC9/GR、A549细胞,观察其对不同突变状态的肺癌细胞增殖抑制作用；(3)不同浓度黄芪甲甙联合吉非替尼作用于人肺癌NCI-H1299、PC9/GR、A549细胞,观察其对不同突变状态的肺癌细胞增殖抑制作用；(4)AS-Ⅳ单独干预细胞以及AS-Ⅳ联合吉非替尼联合干预的细胞后SIRT6的表达水平变化;(5)慢病毒转染PC9/GR细胞,检测AS-Ⅳ联合吉非替尼对转染后PC9/GR细胞增殖水平的影响；(6)探讨在耐药的肺癌细胞中SIRT6和NF-κB信号通路之间相互作用。研究方法：1、利用免疫组化法检测NSCLC肿瘤组织、癌旁组织及良性病变组织中SIRT6的表达量,并收集患者临床资料,分析SIRT6与临床参数的关系；2、 采用qRT-PCR和Western blot实验方法检测人正常肺组织腺上皮细胞BEAS-2B、NCI-H1299、PC9/GR、A549细胞中SIRT6的表达；3、 不同浓度吉非替尼作用于人肺癌NCI-H1299、PC9/GR、A549细胞,以CCK-8法检测细胞增殖抑制率,使用酶标仪读取OD值,按公式计算细胞生长抑制率,描绘细胞生长曲线；4、 不同浓度AS-Ⅳ作用于人肺癌NCI-H1299、PC9/GR、A549细胞,以CCK-8法检测细胞增殖抑制率,使用酶标仪读取OD值,按公式计算细胞生长抑制率,描绘细胞生长曲线；5、 不同浓度AS-Ⅳ联合吉非替尼作用于人肺癌NCI-H1299、PC9/GR、A549细胞,以CCK-8法检测细胞增殖抑制率,计算细胞生长抑制率,描绘细胞生长曲线；6、 不同浓度AS-Ⅳ联合吉非替尼,吉非替尼不同浓度单独作用于人肺癌PC9/GR细胞,使用qRT-PCR检测SERT6 mRNA表达变化；使用Western-blot技术检测SIRT6的蛋白表达变化；7、选择慢病毒进行介导转染,使SIRT6基因真核表达载体转染PC9/GR细胞,倒置荧光显微镜观察荧光表达,测定病毒滴度。Western Blot检测,SIRT6蛋白的表达。检测AS-Ⅳ联合吉非替尼对转染后PC9/GR细胞增殖水平的影响；8、Western-blot检测IκB及NF-κBp65,探讨在耐药的肺癌细胞中SIRT6和NF-κB信号通路之间相互作用。结果：1、结果SIRT6在NSCLC组织中低于癌旁组织及良性病变组织；分化程度高者平均IOD高于分化程度中、低的患者。发生淋巴结转移和未发生淋巴结转移的患者SIRT6的平均IOD之间存在显著性差异；2、通过CCK-8实验,A549、PC9/GR和H1299经不同浓度吉非替尼干预48h后,细胞增殖抑制率,随着浓度的增高,体现剂量依赖性抑制作用。与对照相比,吉非替尼的细胞抑制作用显著差异。吉非替尼半抑制浓度分别为21.29μM、 45.98±1.62μM、26.29±2.25μM;3、采用CCK-8法,选取不同浓度的AS-Ⅳ作用于A549和PC9/GR细胞株,研究发现,当干预时间为48h时,3ng/ml和6ng/ml浓度的AS-Ⅳ对A549和PC9/GR细胞均不能产生明显的抑制作用,而大于12ng/ml的AS-Ⅳ可明显抑制细胞是的生长。选取不同浓度的AS-Ⅳ作用于H1299细胞株,当干预时间为48h时,大于6ng/ml的AS-Ⅳ可明显抑制细胞是的生长；4、用含4个浓度(3ng/ml、6ng/ml、12ng/ml、24ng/ml)的AS-Ⅳ和10μM的吉非替尼培养液联合作用于A549、H11299、PC9/GR细胞,48小时后使用CCK-8试剂酶标仪检测,同一grfitinib浓度,不同浓度的AS-Ⅳ作用于同一细胞株,细胞增殖抑制率显著不同,细胞增殖抑制率随AS-Ⅳ浓度增加而增加。3种细胞均可见gefitinib联合AS-Ⅳ浓度为24ng/ml时细胞增值抑制率最高,但同一grfitinib浓度下,随药物浓度增加,不同细胞的增殖能力不同,PC9/GR细胞增殖能力最差。在12ng/ml的AS-Ⅳ联合10 μ M的吉非替尼作用下Q值最大；5、通过qRT-PCR和Western blotting技术,肺癌PC9/GR、A549、H1299细胞与正常肺组织腺上皮BEAS-2B细胞相比,SIRT6 mRNA和蛋白的表达水平显著下降；6. qRT-PCR分析结果显示,与对照组相比,AS-Ⅳ 12ng/ml联合吉非替尼10μM干预PC9/GR, SITR6mRNA的表达增加,P<0.01。单独AS-Ⅳ 12ng/ml单独干预PC9/GR,与对照组比较,而吉非替尼单独干预PC9/GR,与对照组比较,无统计学意义；Western blotting检测结果,与对照组相比,AS-Ⅳ 12ng/ml联合吉非替尼10μ M干预PC9/GR, SITR6蛋白的表达增加。单独AS-IV 12ng/ml单独干预PC9/GR,与对照组比较；7、吉非替尼浓度梯度0、5、10、20、40μM单独干预PC9/GR,与对照组比较,细胞的SIRT6mRNA及蛋白水平均有所提高,但没有明显统计意义；8、构建了稳定转染SIRT6过表达载体的PC/GR,倒置荧光显微镜下观察,细胞转染效率估计大约在80%-85%,通过Western Blot检测,与对照比较,SIRT6蛋白的表达量有大幅度的提高；9、予以10rtM的吉非替尼和浓度梯度的AS-IV干预pLVTHM-SIRT6和pLVTHM-scramble细胞,SIRT6、吉非替尼和AS-IV联合作用时细胞的生长抑制现象,与其他三组比较明显增强；pLVTHM-SIRT6组与pLVTHM-scramble+吉非替尼组比较无明显统计意义,但与pLVTHM-scramble组比较有统计意义；予以12ng/ml的AS-IV和浓度梯度吉非替尼干预pLVTHM-SIRT6和pLVTHM-scramble细胞,SIRT6、AS-IV和吉非替尼联合作用时细胞的生长抑制现象明显,pLVTHM-SIRT6组与pLVTHM-scramble+AS-Ⅳ比较无明显统计意义,但与pLVTHM-scramble组比较有差异；10、Western blot检测pLVTHM-scramble细胞和Plvthm-SIRT6细胞,IκB在pLVTHM-scramble细胞中的表达水平低于Plvthm-SIRT6细胞,予以AS-IV24ng/ml干预pLVTHM-scramble细胞和Plvthm-SIRT6细胞,IκB在pLVTHM-scramble细胞表达水平低于Plvthm-SIRT6细胞,但与未干预细胞相比,两种细胞IκB水平均有上调：予以AS-IV24ng/m干预pLVTHM-scramble细胞和Plvthm-SIRT6细胞48h后,提取各组细胞核蛋白,Western blot检测NF-κBP65亚单位的表达,NF-κBp65亚单位在Plvthm-SIRT6+AS-IV干预细胞中表达最低,与pLVTHM-scramble细胞相比,SIRT6过表达降低了NF-κBp65亚单位在Plvthm-SIRT6细胞核中的积累。结论：研究表明,1、SIRT6在NSCLC组织及肺癌细胞中的表达下降；2、AS-IV对肺癌细胞有抑制作用,呈现浓度趋势；3、AS-IV联合吉非替尼可增加肿瘤细胞抑制率；4、过表达SIRT6可以抑制NF-κB的活化；5、AS-IV可通过上调SITR6,抑制NF-κB活化,促进了吉非替尼的敏感性。