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第一部分骨性关节炎体外软骨退变模型建立及普伐他汀对其的影响【目的】构建大鼠软骨细胞骨性关节炎软骨退变的体外模型,并检测普伐他汀对炎性环境下软骨细胞基质降解的保护作用。【方法】由大鼠膝关节胫骨平台软骨组织取材分离得到软骨细胞后培养增殖传代;不同浓度(0,5,20以及60μM)普伐他汀处理软骨细胞24小时后使用CCK8法检测其细胞增殖活力;使用梯度递增浓度的普伐他汀(0,5,10以及20μM)预处理软骨细胞2小时后使用IL-1β(10 ng/mL)刺激软骨细胞24小时后收集蛋白和RNA样品,通过实时定量PCR和Western印迹技术检测不同处理组MMP3,MMP13和ADAMTS5等软骨降解相关效应基因和蛋白变化;使用普伐他汀(0或20μM)预处理软骨细胞2小时后,再用IL-1β(0或10 ng/mL)刺激软骨细胞24小时后多聚甲醛固定细胞,之后甲苯胺蓝软骨细胞外基质;使用普伐他汀(0或20μM)预处理软骨细胞,再用IL-1β(0或10 ng/mL)刺激软骨细胞24小时后收集蛋白和RNA样品,通过实时定量PCR和Western印迹技术检测不同处理组MMP3,MMP13和ADAMTS5等软骨降解相关效应基因和蛋白变化。【结果】分离的大鼠软骨细胞均一性高,生长功能良好,增殖性状稳定;不同浓度普伐他汀处理的大鼠软骨细胞,没有导致细胞增殖活力发生显著改变,实验浓度普伐他汀浓度没有对大鼠关节软骨细胞的细胞毒性;普伐他汀对骨性关节炎炎性软骨细胞基质降解发挥了剂量依赖性的治疗效应;普伐他汀可明显减轻IL-1β刺激导致的软骨细胞变性和基质破坏以及下调基质降解相关的效应基因和蛋白表达。【结论】大鼠软骨细胞骨性关节炎软骨退变的体外模型稳定可靠有效。普伐他汀对炎性环境下软骨细胞基质降解具有明显保护作用。第二部分普伐他汀对大鼠软骨细胞骨性关节炎性反应中自噬水平的影响【目的】探索普伐他汀对炎性环境下软骨细胞基质降解保护作用涉及的生理机制。【方法】使用普伐他汀(0或20μM)预处理软骨细胞2小时后,再用IL-1β(0或10 ng/m L)刺激软骨细胞24小时,固定样本,使用CCK8法测量普伐他汀对IL-1β诱导的软骨细胞基质降解的治疗作用中细胞增殖活性的变化;将普伐他汀(0或20μM)预处理2小时的软骨细胞暴露于IL-1β(0或10 ng/m L)刺激24小时,随后收集细胞,应用Annexin V-APC和7-AAD双染色法流式细胞学检测各组软骨细胞凋亡水平;为了评估普伐他汀对IL-1β诱导的软骨细胞基质降解的治疗作用中细胞自噬活性的变化,使用普伐他汀(0或20μM)预处理软骨细胞2小时后,再用IL-1β(0或10 ng/m L)刺激软骨细胞24小时,提取蛋白和RNA样品,通过实时定量PCR和Western印迹技术检测不同处理组atg7,atg12,Beclin1和LC3 II等自噬相关效应基因和蛋白变化;使用GFP-m RFP-LC3腺病毒感染不同处理组软骨细胞,普伐他汀预处理和IL-1β暴露后共聚焦显微镜检测不同处理组中软骨细胞中的自噬流变化。【结果】相对于空白组细胞,普伐他汀处理和IL-1β暴露对关节软骨细胞的增殖没有明显的抑制作用,软骨细胞凋亡率也无明显差异;普伐他汀可以上调炎症环境下软骨细胞受抑制的自噬相关基因和蛋白表达,同时增强炎性环境下自噬体向自噬溶酶体的转换,而对正常软骨细胞的自噬水平没有调控作用。【结论】在骨性关节炎早期炎性软骨退变中,对细胞增殖活性或细胞凋亡水平的调控不是普伐他汀治疗IL-1β诱导的软骨细胞基质降解的作用对象。普伐他汀主要通过恢复炎症环境下受损的自噬活性来减轻IL-1β诱导的软骨退变。第三部分普伐他汀调控大鼠软骨细胞骨性关节炎性反应中自噬水平过程中的相关信号转导通路机制的研究【目的】检测普伐他汀对炎性反应软骨细胞基质保护效应中涉及的信号转导通路。【方法】使用特异性自噬诱导剂雷帕霉素或特异性自噬抑制剂3-MA预处理软骨细胞2小时后,再用IL-1β(0或10 ng/m L)刺激软骨细胞24小时,提取蛋白和RNA样品,通过实时定量PCR和Western印迹技术检测不同处理组MMP3,MMP13和ADAMTS5等软骨降解相关效应基因和蛋白变化;通过蛋白质印迹技术检查在IL1β刺激期间软骨细胞中MAPK通路、PI3K/AKT/m TOR通路、NF-κB通路的家族蛋白磷酸化水平,并评估普伐他汀预处理对各通路激活水平的影响。应用p38的磷酸化抑制剂SB203580和p65的核转位抑制剂JSH-23预处理软骨细胞后IL-1β刺激24小时,收集样品蛋白,检测不同处理组相关通路蛋白磷酸化以及Beclin1和LC3 II等自噬相关蛋白变化。【结果】雷帕霉素恢复了软骨细胞中由IL-1β刺激导致的从LC3 A/B I到LC3 A/B II的转化障碍,而3-MA预处理组则加重了自噬受损。同时,雷帕霉素处理显著减轻了大鼠关节软骨细胞中IL-1β诱导的软骨降解相关金属蛋白酶(MMP3,MMP13和ADAMTS5)的表达增加,而3-MA处理则相反。IL-1β刺激可导致软骨细胞内MAPK通路、PI3K/AKT/m TOR通路、NF-κB通路相关蛋白磷酸化水平显著上升,而普伐他汀预处理则主要抑制了MAPK通路和NF-κB通路的磷酸化。进一步应用相应蛋白活化的选择性抑制剂的实验表明,抑制p38磷酸化可减轻IL-1β刺激导致的软骨细胞自噬损伤,而抑制p65则没有对这种自噬损伤表现出明显影响。【结论】调控软骨细胞炎症反应中受损的自噬活性可以有效影响软骨基质降解的严重程度,自噬是调节骨性关节炎软骨退变潜在的有效作用靶点。普伐他汀减轻炎症刺激相关的自噬损伤主要是通过抑制炎性反应中MAPK通路蛋白磷酸化水平所介导的。