水稻半不育突变体细胞学观察及相关基因克隆的初步研究

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水稻雌配子的正常发育是水稻正常结实的前提,水稻雌配子异常发育会导致水稻产量大幅度降低,因此,对水稻雌配子不育现象的研究具有重要的现实意义。本研究利用EMS诱变‘粤丰B’,获得半不育突变体m21,该材料营养生长正常,花器官外观形态结构正常,但自然结实率为53.52%±2,本研究对半不育突变体m21进行饱和辅助授粉实验,并构建半不育突变体m21的BC1F4和BC1F5回交株系进行花粉育性检测、花粉活力鉴定、突变体胚囊发育时期观察。同时,还以该性状为目标性状,进行基于高通量测序的BSA法分析,对其相关基因进行了初步研究。主要结果如下:1:以半不育突变体m21为母本,使用野生型‘粤丰B’花粉连续3天辅助授粉,结实率与半不育突变体m21自交相比未有显著提升。说明该突变体半不育性是受雌蕊群影响。2:构建半不育突变体m21的BC1F5回交株系,BC1F5回交株系中分离出外观形态接近野生型‘粤丰B’,而平均育性仅为52.30%±2的半不育株系WZN58,使用WZN58进行花粉育性活力鉴定,WZN58碘染后可育花粉为87.16%±1,花粉离体萌发率为72.1%±2,与野生型‘粤丰B’花粉育性和活力经t检验后发现无显著差异。说明其花粉育性及活力正常。3:对WZN58雌配子发育过程进行细胞学观察发现,约50%的胚囊在孢原细胞发育早期就开始出现异常,分化孢原细胞时产生多个孢原细胞样细胞,后续也产生了多个形态与大孢子细胞相似的细胞;发育中期50%的胚囊分化出三个大孢子,接着出现两类异常,一类是三个大孢子从合点端开始逐渐退化,最后全部退化,仅留下退化残迹;另一类是合点端开始退化,最后形成无明显液泡化的单核胚囊;在成熟胚囊期,未观察到结构形态完全正常的胚囊,突变体胚囊体积小于野生型胚囊,呈现典型的蓼型结构,但液泡化程度低,胞质部分凝缩,珠心组织出现部分解体,胚囊壁皱缩与子房壁有脱离现象,胚囊内器官异常情况分为三种:约50%的成熟胚囊具有完整的内部结构,有卵器、两个极核和多个反足细胞,且位置正常;约25%胚囊缺失卵器,胚囊内仅可见极核与反足细胞;约25%胚囊仅具有多个反足细胞,极核和卵器缺失。具有卵器的胚囊比例与突变体结实率相当,说明这部份胚囊异常的植株是可以结实的。4:利用BSA分析法对半不育突变体m21的BC1F4和BC1F5回交株系中的极端个体进行全基因组测序比对,获得具有SNP和InDel差异的候选基因位点,结合细胞学观察结果共获得20个可能影响雌配子育性的候选基因,根据基因预测功能和基因在雌配子中的表达量挑选5个候选基因(Os01g0102400、Os10g0546900、Os04g0350000、Os01g0770400、Os06g0638000)进行转基因敲除验证。本研究为后续对突变体m21目的基因的精细定位及对其功能研究工作奠定基础。水稻外观品质是影响稻米市场价值的主要因素,对于水稻产量也有一定的影响,选育出优良外观品质品种水稻是育种研究的重要方向。因此,对水稻的外观品质研究一直具有重要的研究意义。本研究使用粳稻‘热研2号’与籼稻‘贵9B’构建了家系数量为100的重组自交系群体,先后种植于贵阳与三亚,利用已经构建完成的分子遗传图谱检测不同环境下水稻外观品质的数量遗传性状位点(QTL),主要结果如下:1:相关性分析表明粒长与粒宽、粒厚、垩白粒率的相关性较小,粒宽、粒厚、垩白粒率与除了粒长之外的外观品质性状均表现为显著正相关。这说明粒长的调控机制与其余外观品质调控机制有所不同。2:QTL检测共鉴定到16个QTL,分布在第1、2、3、5、9、10和11号染色体上,LOD值在2.5010.98之间,贡献率在7.64%19.89%之间。3:有2个粒长QTL稳定遗传,两年结果中均检测到,LOD值在2.625.06之间,贡献率在7.64%19.26%之间。有8个QTL的定位区间未见报道,贡献率在8.06%15.13%之间,可能是新的外观品质性状QTL,值得进一步研究。
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