【摘 要】
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丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase, EC:1.2.3.3)是一种焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate, ThPP)依赖型的氧化酶。当无机磷酸和氧分子存在时,在辅酶ThPP、FAD和Mg2+的参与下
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丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase, EC:1.2.3.3)是一种焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate, ThPP)依赖型的氧化酶。当无机磷酸和氧分子存在时,在辅酶ThPP、FAD和Mg2+的参与下,丙酮酸氧化酶能催化丙酮酸氧化脱羧生成乙酰磷酸、CO2和H2O2。丙酮酸氧化酶在生化检验中发挥着重要的作用,包括临床生化检验、环境检测以及传感器中用于即时在线检测发酵生产中重要的中间产物丙酮酸。在本论文中,对丙酮酸氧化酶进行了异源表达和纯化,为了促进丙酮酸氧化酶在生物传感器中的应用,对酶的固定方法进行了研究探讨。首先将绿色气球菌(Aerococcus viridans ATCC 10400)来源的丙酮酸氧化酶基因AvPOX导入大肠杆菌E. coli BL21(DE3)进行诱导表达。然后通过镍柱亲和层析对粗蛋白进行分离纯化,纯化后的蛋白用4-氨基安替比林显色法测定其活性,结果显示,丙酮酸氧化酶基因AvP OX在大肠杆菌表达载体中实现了表达,比酶活为1.0 U/mg。同时尝试了选择不同纤维素结合域与丙酮酸氧化酶基因融合,分别构建了融合基因原核表达载体pET24d/ POX-CBD-His、pETM10/His-POX-CBD、pET24d/POX-CBM3-His、pET 28a/ CBM3-POX -His,并检测融合蛋白酶活以及与纤维素Avicel pH101结合效率Wt。结果显示,与纤维素标签CBM3融合表达的重组蛋白,其比酶活达到0.3 U/mg,结合效率Wt为11.0mg/(g·h)。本论文工作成功制备了兼具纤维素结合能力和丙酮酸氧化酶活力的新型蛋白,为后期开发新型生物传感器元件奠定了坚实的基础。
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