目的： 建立针对以血小板衍生生长因子受体-β（platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β）和血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）为靶标的特异及灵敏的细胞模型体系，用于酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase，RTK）抑制剂的筛选和研究。 方法： 1、pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2真核表达载体的构建：利用TRIZOL提取人胚肝二倍体细胞（CCC-HEL）的总RNA，运用RT-PCR方法扩增目的片段PDGFR-β和VEGFR-2。分别将其定向插入pcDNA3.1表达载体的限制性酶切位点KpnⅠ和XbaⅠ之间，构建pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2。分别利用PCR初步鉴定重组表达载体pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2，再经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2，最后测序进一步鉴定pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2序列的准确性。 2、NIH3T3稳定转染细胞株的建立和鉴定：把重组表达载体pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2采用磷酸钙共沉淀法分别转染至NIH3T3细胞株，利用G418的药物选择特性，对转染细胞进行压力筛选，并对其进行RT-PCR鉴定，最后运用Western blot检测目的基因蛋白表达情况。 3、NIH3T3稳定转染细胞株功能学的鉴定：采用MTT法在稳定表达PDGFR-β或VEGFR-2的NIH3T3细胞株对其配体和时间依赖性生长实验。结果提示NIH3T3稳定转染株获得了PDGF/VEGF因子依赖性增殖/存活特征。 4、HeLa瞬时转染细胞株的建立和鉴定：把重组表达载体pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2采用FuGENE6试剂分别转染HeLa细胞株，运用RT-PCR和Western blot检测PDGFR-β/VEGFR-2.的基因和蛋白表达情况。 5、细胞模型的应用： （1）高通量酪氨酸激酶抑制剂细胞筛选平台的建立及应用分别在稳定表达PDGFR-β/VEGFR-2的NIH3T3细胞株及HUVCE细胞株（天然表达VEGFR-2）上，应用MTT检测方法，对候选的化合物进行了PDGF/VEGF依赖性细胞增殖抑制作用的筛选。 （2）PDGFR-β和VEGFR-2磷酸化分析平台的建立及应用对筛选出具有PDGF/VEGF依赖性细胞增殖抑制作用的先导化合物在瞬时转染PDGFR-β/VEGFR-2的HeLa细胞株上，应用Western blot检测手段，观察先导化合物对PDGF/VEGF依赖性受体磷酸化的抑制作用。在HUVCE细胞株上，应用免疫沉淀和Western blot检测手段，观察先导化合物对VEGF依赖性受体磷酸化的抑制作用。 6、统计采用SPSS12.0分析软件进行分析，具体采用卡方检验、t检验及Spearman相关性检验进行分析，当P<0.05，认为有统计学意义。 结果： 1、真核表达载体pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2经测序其目的片段与理论预计一致。 2、对稳定转染NIH3T3细胞株和瞬时转染HeLa细胞株行RT-PCR和Western blot检测结果分别证实目的基因整合入细胞基因组，且显著表达PDGFR-β/VEGFR-2蛋白。 3、在稳定转染NIH3T3细胞株上，进行配体和时间依赖性生长实验结果提示它们具有PDGF或VEGF因子依赖性增殖/存活特征。 4、经PDGF和VEGF依赖性细胞增殖实验的筛选具有针对PDGF和/或VEGF先导化合物，进一步对其进行受体磷酸化抑制作用的测定结果显示：它们具有对PDGFR-β和/或VEGFR-2磷酸化的显著抑制作用。 结论： 1、通过分子克隆、细胞转染等方法分别成功构建稳定表达PDGFR-β或VEGFR-2的NIH3T3细胞株，并在此基础上成功建立酩氨酸激酶抑制剂的高通量细胞筛选平台（High throughput screening，HTS）。 2、通过分子克隆、细胞转染等方法分别成功构建瞬时表达PDGFR-β或VEGFR-2的HeLa细胞株。也在此基础上成功建立酪氨酸激酶抑制剂的受体磷酸化分析平台。 3、在HUVCE细胞株上，成功构建VEGFR-2抑制剂的高通量细胞筛选和VEGFR-2磷酸化分析平台。 4、经过所建立高通量酪氨酸激酶抑制剂细胞筛选平台的试验研究，筛选出部分先导化合物，再经受体磷酸化分析进一步得到证实。为课题的研究提供重要参考资料和奠定坚实的基础。